Хеликс или инвитро где лучше: ИНВИТРО — мнение специалиста о качестве анализов

Содержание

ИНВИТРО — мнение специалиста о качестве анализов

В Facebook хороший пост про лабораторию Инвитро и про качество анализов в этой лаборатории по следам обсуждения в одной из групп соцсети.
Процитирую тут весь пост полностью.
***

Врачебная порча. ЧАСТЬ 6. Миф о лабораторных анализах или вся правда о ИНВИТРО!

Сегодня мы вообще перейдем на личности, упомянув имя лаборатории… А знаете что меня сподвигло на эту статью? А вот буквально вчера в фейсбуке, в группе промамское выдалась темка, в которой обсуждалось, что многие врачи не советуют сдавать анализы в инвитро. Мол, халтурят, кровь сворачивается у них, теряют анализы итд. Вооот, давайте разберемся подробнее что на самом деле происходит, а то ведь мир интернета полнится слухами, ага…. А слухи эти от якобы очень авторитетных врачей, да,да!!

Сразу скажу, что я не ангажирован, не аффилирован и не прикормлен инвитро, то есть, я вообще отношения к этой лаборатории не имею и не имел никогда. Ни прямого, ни косвенного и людишки, которые больше верят слухам, чем человеку ,имеющему действующий сертификат врача клинической лабораторной диагностики и отработавшим в одной из самых крупных лабораторий России, могут остудить свой пыл, намереваясь меня обвинить в лоббировании кого-либо или чего-либо!

Ну, начнем! Итак, первый миф. Инвитро — это мелкая полуподвальная лаборатория, мы там были не раз, они в подвале сидят. Остудитесь, товарищи. Инвитро — это один из крупнейших игроков в этом сегменте медицины, а то, что вы называете полуподвальной лабораторией — это всего лишь франчайзинговые офисы, которые могут открыть все желающие, заплатив пару миллионов и повесив вывеску ИНВИТРО. Но это не значит, что анализы делаются там же. Инвитро предоставляет своим франчайзи расходники, а курьер забирает биоматериал в строго определенное время и доставляет в собственную лабораторию, где происходит сам процесс производства… Да, да, это так и называется!

Второй миф. В инвитро делают руками анализы и все зависит от смены врачебной.

Если гастарбайтеры в смене, то сделают неправильно, поэтому кровь сворачивается и результаты непонятные. Вот это вообще редкостный бред. Во-первых, такая лаборатория за сутки, а работают такие лаборатории именно круглосуточно, обрабатывает десятки тысяч проб и если все делать руками, то штат лаборатории будет многотысячным, что приведет к тому, что цены на анализы будут в десятки раз выше, чем они есть сейчас. Почти все анализы выполняются на автоматических анализаторах ведущих мировых фирм и точность измерений у них в сотни раз выше чем при ручном исполнении. Руками могут делаться только микробиологические посевы, определения чувствительности к антибиотикам и некоторые ИФА, ИХЛА анализы. [В лаборатории сейчас, судя по разделу «Оборудование» на сайте, минимум 2 микробиологических анализатора, и система преаналитической сортировки, т.е. ручную работу и «человеческий фактор» в ошибках стараются свести к минимуму].

Третий миф. У них нормы анализов неправильные. В учебнике медицинском написаны другие нормы анализа крови. Вот тут очень распространенная ошибка. В учебнике может быть написано что угодно и это будет далеко от правды. у каждой лаборатории могут быть свои нормы и они могут отличаться от норм других лабораторий. Нормы или РЕФЕРЕНСНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ устанавливаются не лабораторией, а производителем расходных материалов, которые использует лаборатория! к сожалению, многие врачи это тоже не знают и тоже ссылаются на учебники 60-70-хх годов, звоня в лабораторию и устраивая скандал, что, мол, не знают как трактовать анализ, поскольку референсы отличаются от написанных в учебнике….

.

Четвертый миф. Инвитро экономит на анализах и выдумывает результаты не делая реального анализа. Ну, тут я вообще комментировать ничего не буду, извините. Это уже больше похоже на постпохмельный синдром. Это подсудное дело и каждая пробирка, которая отправляется в лабораторию, после выполнения анализа хранится до 14 дней и может быть отправлена в повторную работу, если есть сомнения в результате или нужен дозаказ для исполнения из этой же пробирки. Такое, например, случается, когда выполнен анализ, резултат пришел к врачу, а он хочет посмотреть еще некоторые параметры, исходя из полученного результата. Тогда делается доназначение и из уже имеющейся пробирки делается новый забор для анализа. Об этом, кстати, мало кто знает, но это можно использовать!
Нельзя сказать, что все гладко, есть проблемы и в лабораторной диагностике. Так, например, 2-5% всех анализов могут быть выполнены с ошибками. и это не проблема инвитро, это общемировая практика. Ну да, к сожалению….


______________________________________________________________

а теперь традиционное отступление и вся правда о врачах. Проблема, товарищи, не в лаборатории, а в квалификации наших врачей или, что еще хуже, в любви наших людей к самодиагностике, самоназначению и самолечению.
Большинство ошибок случаются не во время производства анализа, а на преаналитическом этапе, то есть, на этапе забора анализа. Есть определенные правила преаналитики, которые нарушаются нашими врачами и франчайзи направо и налево, происходит это из-за низкой квалификации медицинского персонала, но признавать это они не хотят, легче обвинить лабораторию.

Так, например, я сталкивался со скандальными хирургами, которые отправляют в лабораторию гной на микробиологический посев и определение чувствительности к антибиотикам. Таких примеров сотни и сотни. И среди этих врачей заслуженные деятели, доктора наук, профессора. Но ни один из них не знает, что из гноя хрен что можно вырастить, поскольку по определению — это мертвые микроорганизмы, плазма крови и такие же мертвые лейкоциты…. . А вырастить что-либо можно только из живого…. Но зато спорить и орать, и бить себя в грудь, что все плохие, а они все правильно делают они горазды!
Еще хреновее дела обстоят с гинекологами. Эти вообще любят брать анализы не особо понимая зачем и для чего и еще меньше понимая правила забора анализов в гинекологии. Так, например, для большинства мазков гинекологических нужно брать отделяемое влагалища, уретры или цервикального канала. Но именно отделяемое, а не выделяемое. Не чуете разницу?? Вот, вот, гинекологи тоже не чуют и берут как раз выделяемое, а не отделяемое. То есть, то что влагалище само собой выделяет, то есть, выделения, в то время как по правилам как раз-таки нужно эти выделения полностью убрать и сделать соскоб со слизистой, то есть, отделить эпителий. Большинство мазков выполняются методом полимеразной цепной реакции, сокращенно ПЦР, в которой кровь и слизь могут выступать ингибитором реакции и приводить к ложноотрицательному ответу.
И так можно и дальше рассказывать, а рассказать есть много чего. В каждой методике есть правила преаналитические и их должны знать именно те, кто осуществляет забор анализа.

Итак, итоги! Минимальный набор знаний, так сказать!

1. Если Вы делаете себе самодиагностику, назначаете анализы то потрудитесь прочитать многотомные труды по лабораторной диагностике или хотя бы позвонить в медицинский отдел лаборатории и узнать правила забора того или иного анализа.

2. Референсные значения. Помним, что они у каждой лаборатории могут отличаться и если Вы сдаете анализы в динамике, то сдаваться они должны в одной лаборатории, а не в нескольких, тогда Вы сможете четко проследить динамику и оценить качество лечения. [Моя статья про референсные значения].

3. Всегда лучше сдавать кровь из вены, а не из пальца. К сожалению, многие врачи утверждают, что кровь из пальца лучше сдавать, тем более маленьким детям. Это ОШИБКА! Современные пробирки вакуумные, что обеспечивает наполнение их кровью по градиенту давления и минимальную травматизацию, а также сохранность крови за счет отсутствия контакта с внешней средой и наличию консерванта внутри пробирки, то время как все эти критерии отсутствуют при заборе крови из пальца.

Процедура эта намного более травматична и степень достоверности анализа может быть ниже чем при заборе из вены.

4. Спермограмма. Вот ее лучше сдавать не в заборном пункте, расположенном в далеке далеком, в офисе франчайзи, а в заборном пункте, расположенном в самой лаборатории, это обеспечит минимальный срок доставки к врачу-лаборанту и более достоверный результат. Кстати, тут тоже следует помнить, что получив не очень хорошие результаты спермограммы, грамотный врач не спешит назначать лечение, а делает расследование всех причин, собирая информацию про преаналитический этап и делает вывод о необходимости назначения лечения только исходя из результатов 2-3 спермограмм, сданных за определенный интервал времени.

5. Посев крови на стерильность. Вообще не рекомендую сдавать этот анализ, который так любят назначать врачи. Это бред полный. Кровь изначально стерильна ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ! В ней нет бактерий, из которых можно вырастить колонии и сделать микробиологический тест на чувствительность к антибиотикам. Если врач назначает этот анализ, значит он полнейший идиот! ВАЖНО ЗАПОМНИТЬ! заболевание, при котором кровь перестает быть стерильна называется СЕПСИС, мать перемать… Покурите гугл и посмотрите картинки как выгядит человек, больной сепсисом. Он не ходит по врачам, он лежит и отходит в мир иной… Вот у него можно взять кровь на стерильность, у остальных — бессмысленно!

6. Общий анализ крови. Можно брать не только утром и не только натощак. Если вы поели и сдали общий анализ крови сразу после еды, то можете не беспокоиться, его достоверность не снизится, но это не касается биохимических анализов!

7. Гормоны! Очень важно знать преаналитику! Многие гормоны имеют ритмичность пиков выработки и некоторые гормоны следует сдавать строго в определенное время, а также в состоянии покоя. Так, например, любимый гинекологами пролактин имеет тенденцию к значительному повышению почти по любому поводу( утрирую, конечно). И если у Вас повышен пролактин, для врача это уже повод назначить Вам рентген турецкого седла или МРТ гипофиза, в то время как всего лишь стоит переделать анализ или потрудиться узнать при каких условиях был сбор анализа. Свидетельствовать о вероятности наличия аденомы(пролактиномы) передней доли гипофиза может значение пролактина выше 800-1000 ед. Не спешите сразу делать МРТ головного мозга и падать в обморок вместе со своим врачом, нередко достаточно лишь пересдать анализ, чтобы убедиться, что все ОК.

В общем, уже по традиции желаю Вам всем крепкого здоровья, в эфире с Вами был Истомин Никита Юрьевич, врач клинической лабораторной диагностики, врач акушер-гинеколог, врач ультразвуковой диагностики, врач-остеопат. Группе промамское привет, надеюсь, я ответил на Ваши вопросы. Если есть еще вопросы, постараюсь ответить!
_____________

как сделать правильный выбор? › Статьи и новости › ДокторПитер.ру

Наше желание сэкономить время и деньги на медицинское обслуживание породило новый тренд – минуя стадию обращения к врачу, многие идут сразу в диагностические лаборатории и проводят необходимые исследования. В ответ на спрос в Петербурге рынок лабораторной диагностики расширяется — центры открываются едва ли не каждый месяц.

Пациенты выбирают анализы без очереди

Медицинская информированность населения стала своеобразным двигателем развития медицинского бизнеса. Его используют фармацевты, отпускающие лекарства человеку, поставившему себе диагноз с помощью интернета, его используют и лаборатории. Число пациентов, обращающихся в них без направления врача, растет, а это хороший стимул для развития бизнеса. Крупные диагностические лаборатории уже и рекламные компании ведут по принципу ритейла (дословный перевод – розница). То есть, нацелены на работу не только с корпоративными, но и с индивидуальными клиентами, точнее, с множеством клиентов. Им это удается и благодаря плачевному состоянию нашего здравоохранения, особенно в амбулаторной помощи: пациенты с направлениями врача тоже идут – не хотят проводить время в очереди в районной поликлинике или хотят сэкономить на анализах (в лаборатории дешевле, чем в частной клинике). Кроме того, как на одной из конференций сказал директор департамента розничных продаж «Инвитро» Сергей Амбросов: «Современная лабораторная диагностика позволяет эффективно использовать деньги людей. Выявить заболевание на ранней стадии экономически выгоднее, чем заниматься лечением, когда болезнь перешла на более поздние стадии».

Заинтересованность пациентов в этой услуге понятна. А зачем эта головная боль лабораториям, если можно спокойно, без затрат на сервис работать с корпоративными клиентами – многопрофильными больницами, поликлиниками, частными медицинскими учреждениями? Тем более что, как пояснил «Доктору Питеру» заместитель генерального директора Лабораторной службы «Хеликс» Павел Яблоков, «работа с частным клиентом значительно сложнее. Она требует вложений и организационной перестройки компании. Нужно создавать собственный call-центр, обрабатывать звонки, нанимать докторов, арендовать офисы под пункты забора материала, создавать службу урегулирования претензий, перестраивать логистику, работать над имиджем». Но все затраты окупаются, поскольку именно в этом сегменте рынка потребительский спрос растет быстрее всего. Так называемый средний чек от частного клиента выше, чем аналогичный показатель у клиентов корпоративных — они ведь покупают услуги лабораторий оптом.

Кто играет на рынке

Еще недавно человек, ставящий баночку с мочой в указанное окошко, ничего не знал о лаборатории, в которой будут исследовать его «биоматериал». Это, как правило, была сторонняя организация, работающая по договору с клиникой. Теперь, с развитием этого вида медицинского бизнеса медучреждения превращаются в посредников между пациентом, которому необходимы исследования, и лабораторией, которая их выполняет. Если посредник их устраивает, пациент пользуется им, не устраивает — идет в лабораторию самостоятельно.

Лидерами на рынке лабораторной диагностики в Петербурге являются компании «Хеликс», «Инвитро», «СитиЛаб», «Иммунобиосервис», «МедЛаб», «Северо-Западный центр доказательной медицины», «ЛабТест». Маленькие лаборатории («БиоТехМед», ЛИИС, «Независимые медицинские лаборатории», «Риат») изначально ориентированные на работу только с корпоративными клиентами, тоже приглашают к себе «свободных» пациентов сдавать анализы. Но конкурировать с крупными компаниями не могут – выигрывают только за счет более низких расценок на исследования.

Совсем новая лаборатория на нашем рынке – «ЛабСтори». Появилась она с заявкой на лидерство, но, по свидетельству коллег, даже не могла выполнять ряд анализов в своей лаборатории – обращалась в другие за их выполнением. В результате задолжала нескольким петербургским компаниями за проведенные исследования крупную сумму и до сих пор не расплатилась.

Много лабораторий хороших и разных

Большинство лабораторных сетей, занимающих лидирующие позиции на диагностическом рынке города, начинались именно с лабораторий, а потом к ним «прирастали» клиники.

Так происходило и с «МедЛабом», и с «ЛабТестом» и с «Северо-Западным Центром доказательной медицины». Однако самая первая частная лаборатория «Иммунобиосервис», хоть и пошла по такому пути, но сетью так и не стала, хотя до сих пор лидирует в узком сегменте этого рынка. «Иммунобиосервис» был основан в 1991 году Сергеем Сельковым, д.м.н., профессором, заведующим лабораторией иммунологии Института акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта и специализировался на иммунологических исследованиях (инфекционные болезни, иммунодефицитные состояния, бесплодие, невынашивание беременности и другая репродуктивная патология). Специализация сохраняется и до сих пор, несмотря на то, что лаборатория превратилась в полноценный медицинский центр, в котором ведут прием врачи разного профиля. В чем преимущество у комплекса «лаборатория+медцентр»? Заместитель генерального директора «Иммунобиосервиса» Мария Селькова объясняет так:

— Мы работаем со многими клиниками города, но в них не все врачи владеют информацией о том, какие исследования мы выполняем (их более 500), и о том, что нового появляется. А врачи нашей клиники прекрасно осведомлены о возможностях лаборатории и назначают именно ту диагностику, что необходима в каждом конкретном случае.

Совсем недавно «МедЛаб» открыл седьмой медицинский центр в Рыбацком. Главное отличие «МедЛаба» от других сетей — в том, что в первом центре на пр. Обуховской Обороны можно выполнить исследования по полису ОМС (полис компаний РЕСО-Мед и Аск-Мед). «МедЛаб» — первая в Петербурге частная лаборатория, которая вошла в систему ОМС и в одном из ее центров пациенты могут рассчитывать на бесплатное проведение иммунологических исследований при предъявлении полиса, паспорта и направления врача.

Как сообщила специалист по связям с общественностью Любовь Дубова, самые популярные исследования – это анализы на гормоны и половые инфекции. Но растет и потребность в более редких исследованиях – иммунограмме, генодиагностике (в том числе в составлении «генетического паспорта»), исследованиях на свертывание крови. Понятно, что, как и в других комплексных центрах, основным видом деятельности которых является лабораторная диагностика, задача врачей – назначить по показаниям исследования, направить на анализы и в результате поставить диагноз.

Как заманить пациента в сети

У всех лабораторных сетей города практически одинаковое современное оборудование, они, как правило, пользуются реагентами одних и тех же поставщиков. Отличия — в наборе исследований (каталоге) и сервисе – тоже, как правило, незначительные. Почти все имеют службу выезда на дом для забора анализов, могут выслать результаты на электронную почту, а «Хеликс» еще и отправляет смс-сообщения о том, что результаты готовы. Чтобы привлечь «свободных» пациентов компании экспериментируют с ценами на исследования, ищут индивидуальные подходы к клиентам. Например, «Северо-Западный центр доказательной медицины» объявил о том, что с 1 ноября 2011 года начал выполнять лабораторные анализы для животных.

Один из лидеров рынка лабораторной диагностики – сетевая компания «Инвитро», прибывшая к нам около 10 лет назад из Москвы, любит организовывать акции. Ту, что проводится сейчас, можно назвать акцией по переманиванию пациентов других лабораторий: с 10 ноября по 31 декабря во всех офисах, работающих под брендом «Инвитро» в Петербурге и в Выборге, обладатель дисконтной карты любого медицинского центра или лаборатории, в которых оказываются услуги по лабораторной диагностике, получает разовую 10-процентную скидку на любые исследования и даже на забор биоматерила. Компания ведет очень активную ретейловскую политику, организовывая акции ВКонтакте, объявляя скидки на скрининговые программы и выполняет анализы, которые не проводятся ни в одной другой лаборатории, например, исследование качества продуктов, воды и почвы.
Московская компания «СитиЛаб», около 7 лет назад появившаяся в Петербурге, стремительно догоняет лидеров – «Хеликс» и «Инвитро», только в этом году она открыла еще три центра (последний – в ноябре) и теперь их у нее 12. Ее поведение на рынке напоминает поведение «Инвитро» — «СитиЛаб» регулярно пытается привлечь пациентов акциями и скидками. Например, до 15 января в шести центрах этой лаборатории можно выполнить анализы со скидкой 20%. Как и «Инвитро», открывает при центрах забора биоматериала кабинеты УЗИ-диагностики.

Как говорят участники рынка, очень часто бывает, что дополнительные медицинские услуги при лабораторных офисах открывают просто для того, чтобы не пропадали площади. Для забора крови нужен-то всего один кабинет, а в офисе их обычно 2-3.
Другой лидер рынка – компания «Хеликс» сознательно ограничивает перечень дополнительных медицинских услуг в своих диагностических центрах, в отличие от тех же «Инвитро» и «СитиЛаб». Прием ведут только терапевт, эндокринолог, уролог и гинеколог – то есть, те врачи, для которых диагностика в наибольшей степени сопряжена с лабораторными исследованиями. Кроме того, в одном из диагностических центров «Хеликс» открылся прием врача-генетика, также ориентированного на назначение и интерпретацию соответствующих лабораторных исследований. При этом «Хеликс» тоже активно развивается — имея более 40 диагностических центров в Петербурге и пригородах, он открывает свои лаборатории в других регионах страны, в том числе в Москве. Почему «Хеликс» не ставит перед собой задачу обрасти медицинскими центрами или хотя бы кабинетами врачей – узких специалистов в разных областях? Павел Яблоков объясняет это так:

— Мы не участвуем в соревновании, кто больше комплексных услуг предложит пациенту. Мы делаем в основном анализы – это наша главная сфера компетенции. У нас больше 50 центров в разных городах страны. В них можно установить разнообразное оборудование для функциональной диагностики, можно открыть кабинеты с самыми модными видами медицинских и околомедицинских услуг, но зачем? Пусть аппаратным исследованием занимаются профессиональные клиники с качественным дорогим оборудованием, которого ни одна лаборатория позволить себе не может. А наше дело – медицинские анализы. Просто мы сторонники классического подхода, при котором сапоги тачает сапожник…

За место на рынке

Наш рынок лабораторной диагностики сложился стихийно и, как утверждают его участники, до конца не сформировался. Более того, по прогнозам он будет расти. Сегодня на нем надежную позицию занимает и медицинский центр с лабораторией, не имеющей филиалов, и большие сети. Маленькие лаборатории, оснащенные далеко не всегда по последнему слову медицинской техники тоже находят своего пациента. И все утверждают, что конкуренция на рынке честная, за исключением одного игрока («ЛабСтори» коллеги теперь не жалуют), который ведет себя «неспортивно». Но сети растут и множатся, нет ли опасности, что они, в конце концов, поглотят мелкий лабораторный бизнес?

— Думаю, что рано или поздно рынок лабораторной диагностики будет развиваться по тем же законам, по которым он развивался за рубежом, – объясняет Павел Яблоков. — Лидер лабораторной диагностики в Америке — компания Quest – самая большая компания в мире с оборотом больше 8 млрд долларов в год, она занимается только анализами. Для доставки образцов в лаборатории у них одних только самолетов не меньше 25-ти. Компания №2 в мире — тоже американская. И обе эти огромные компании охватывают в Америке около 40 % рынка, 5% — у мелких лабораторий, а основная часть – у средних. Думаю, это и есть наш сценарий развития. На чем мелкие и средние будут выживать, вариантов много. Например, займут свою нишу в узком спектре анализов. Уже сейчас некоторые небольшие петербургские лаборатории, в том числе при медицинских учреждениях специально не расширяют этот спектр, и именно они, скорее всего, будут позиционироваться как компании, которые здорово делают, например, иммунологию или генетику. Если специализация будет означать и высокий уровень качества, то большие компании будут делать у них эти исследования и рынок разделится по специализациям. Так произошло на Западе, будет правильно, если так сложится и у нас. Сейчас мы в рамках сотрудничества заказываем какие-то исследования друг у друга на договорной основе, просто в силу финансовой целесообразности. Рынок идет к тому, чтобы появились внутрилабораторные аутсорсеры и распределение труда. Совсем недавно эта тенденция появилась в Москве, значит, к нам она придет года через два.

Конкурент ли государство?

Сегодня по программе модернизации системы здравоохранения в городских районах создаются хорошо оборудованные централизованные лаборатории: на уровне амбулаторной помощи исследования пытаются централизовать в рамках районных диагностических центров. И учреждения будут направлять туда анализы, которые они должны делать в рамках стандартов медицинской помощи. Как только закончатся сложности, неизбежные в условиях одновременной модернизации и реформирования, эти центры начнут оказывать платные услуги, значит, у частных лабораторий появится еще один конкурент.

Однако участники лабораторного рынка пока так не считают. Во-первых, потому что в государственных лабораториях всегда не хватало реагентов, а кто сказал, что с установкой нового оборудования перебои с ними исчезнут? Во-вторых, чтобы конкурировать на сложившемся рынке, нужен грамотный менеджмент, нужна возможность срочно заключать договоры с другими лабораториями при форс-мажорах. Такой возможности у государственных учреждений нет из-за нашего законодательства. В результате будет то же, что и сегодня: чтобы выполнить анализ на гормоны надо ждать две недели. Не потому, что такая большая очередь, а потому что надо набрать не меньше 12 пациентов, которым требуются такие же исследования, — для одного человека они ровно в 12 раз дороже. Значит, либо поликлиники будут их копить пару недель, либо пациент вынужден обратиться в частную лабораторию: там тоже каждый день их не делают (не чаще двух раз в неделю), но можно выбрать именно ту, что выполняет это исследование именно сегодня.

Компаний, которые работали бы на одного клиента и совсем не предлагали бы услуг от своего имени, нет, в том числе и существующих при частных и государственных клиниках. Потому что если лаборатория остается в рамках своего медицинского учреждения, спросом на ее услуги воспользуется кто-то другой. И этот другой уже появляется на рынке – перекупщик. Компания, у которой нет лабораторной базы, но есть помещение для забора крови. Она нанимает медсестру, собирает анализы, а выполняет их в лаборатории, с которой заключила договор, зарабатывая на разнице в цене. Все говорит о том, что спрос на лабораторные услуги в городе есть и он будет расти.

А тем временем петербургский «Хеликс», московские «Инвитро» и «СитиЛаб» активно продвигаются в регионы. И при этом сами задают себе вопрос: а правильно ли они делают? Особенность этого бизнеса в том, что он хорошо развивается в мегаполисах. Если в российской глубинке человеку предложат сдать анализы за свой счет в какой-то лаборатории, он сильно удивится.

Сравнительная таблица стоимости самых распространенных исследований в некоторых лабораториях Петербурга

  «Хеликс» «Инвитро» «Медлаб» «Иммунобиосервис» «Северо-западный центр доказательной медицины»
Забор крови из вены 140 140 150 90 120
Клинический анализ крови 440 470 350 250 410
ПСА общий 380 420 200 440 360
Эстрадион 360 360 300 310 350
Прогестерон 330 330 230 310 310
Иммуноглобулины 210 210 200 250 210
Определение специфических иммуноглобулинов к одному аллергену 355 360 160 260 400
Спермограмма 880 1070 950 660 850
Анализ мочи общий 205 200 200 250 170
Клинический анализ кала 300 300 300 300 300

Ирина Багликова

© Доктор Питер

Сеть «Хеликс» попала в список лучших лабораторий

Лабораторная служба «Хеликс» стала первой сетью лабораторий в СНГ, получившей аккредитацию Коллегии американских патологов (CAP). Таким образом компания получила международный сертификат стандартов качества лабораторной диагностики и была включена в список лучших лабораторий мира.

ДЛЯ СПРАВКИ: CAP — лидирующее международное сообщество практикующих сертифицированных патологов, которое поощряет и пропагандирует использование лучших практик лабораторной медицины по всему миру в течение уже более 70 лет. За это время сформировано почти 3000 требований к выполнению стандартов лабораторной диагностики. Они дополняются и обновляются ежегодно при участии более 500 экспертов. При этом требования СAP превышают требования ключевого отраслевого стандарта, принятого для медицинских лабораторий, ISO 15189.

Аккредитация CAP помогает лабораториям гарантировать достоверность результатов анализов и, как следствие, обеспечивать точный диагноз для пациента, говорят представители «Хеликс».

Подготовка к получению аккредитации заняла у компании более двух лет и завершилась трехдневным аудитом московского лабораторного комплекса независимыми экспертами CAP. В рамках аудита отделения сети еженедельно получали «слепые» образцы биоматериала для проведения аналитики. В подавляющем большинстве случаев при исследовании «слепых» образцов лаборатории были не известны пол, возраст и анамнез пациента.

Помимо процесса исследований тщательным проверкам подверглись складские площади компании, где хранятся реагенты; также была оценена квалификация персонала, участвующего в выполнении исследований, и системы безопасности и охраны труда. Не остались без внимания и IT-алгоритмы валидации результатов лабораторных исследований.

«Одно из ключевых требований CAP — аккредитация лабораторного комплекса полностью, а не какой-то его части или группы исследований», — отмечает Ирина Ивановна Скибо, директор по технологиям и проектной работе «Хеликс».

На сегодняшний день бренд «Хеликс» присутствует в 130 городах России. По вывеской сети открыто более 350 диагностических центров и лабораторных пунктов, 330 из них работают по франшизе.

Экскурсия в лабораторию Helix — Я не боюсь идти по дороге — LiveJournal

. Но для того, чтобы туда попасть, нужно было внести особую дань — свою собственную кровь! Или, выражаясь, современным языком, нужно было сдать анализ крови, чтобы потом пойти в лабораторию и самим провести исследование.

Пока я направлялась в Хеликс на Карповке, моё сознание рисовало страшные картины, навеянные детскими воспоминаниями: медсестра с размаха всаживает в твой ни в чем не повинный палец иглу, на пальце выступает капля крови, но течь совсем не хочет, всё та же медсестра с садистскими усилиями начинает выжимать палец подобно белью после стирки, а потом усердно размазывать твою алую кровь по стёклышку. О, а иногда она ещё брала специальную грушу и выкачивала кровь с её помощью…

Руки как назло замёрзли даже в перчатках и предательски посинели. И как раз накануне в книжке «Год в Провансе» я читала про то, как одному фермеру не могли проткнуть палец и долго тыкали в него иголкой. В общем, я была готова ко всему.

Следующий этап, этап исследования, я представляла себе в других красках — как мы все будем смотреть в микроскоп на свои кровяные тельца, развозюкивать кровь всё по тому же стёклышку и прочие лабораторные подробности.

Справка: Лабораторная служба Хеликс работает в сфере лабораторной диагностики с 1998 года. В настоящее время является одним из лидеров лабораторной диагностики в России. Под брендом Хеликс открыто более 170 Диагностических центров и Лабораторных пунктов по всей стране. Лабораторная служба Хеликс выполняет анализы для более чем 750 частных и более чем 150 государственных медицинских учреждений, оказывает услуги клиентам в 96 городах России, имеет 3 технологических площадки площадью более 4 000 кв. м. в Москве, Санкт-Петербурге и Екатеринбурге.

3
Сначала нужно было заполнить документы, выбрать вид анализа (общий клинический или на холестерин) и уже только потом отправиться в кабинет.
Тут мои страшные ожидания не оправдались — кровь берут из вены, а это, как известно, вообще не доставляет никаких дискомфортных ощущений, в отличие от издевательств над пальцем.
Тут же даже висит информация обо всех плюсах:

4
Когда все сдали кровь и получили за это гематоген, пришёл курьер. Он забирает биоматериал (именно так это называется) и несёт его в лабораторию. Мы двигаемся за ним — для того, чтобы оказаться в лаборатории, нужно пересечь двор.

5

6
Женя nau_spb тут же раздобыл кота:

7
Тут уже нас поджидают наши биоматериалы:

8
Кровь благородного алого цвета.
Маркировка «cito» означает, что наши анализы — срочные.

9
Срочные анализы в Хеликсе делаются три часа. Как только всё готово, на телефон приходит смс, на электронную почту — результаты.
Эта лаборатория Хеликса одна в Петербурге, всё остальное — это пункты приёма биоматериала. Поэтому если вам нужно срочно и быстро, надо идти сюда, на набережную Карповки, 5.
В лабораторию везут анализы не только из других районов Петербурга, ну и из других городов. Даже из Владивостока!
Почему?
Во-первых, лаборатория прекрасно оснащена и таких качественных у нас немного.
Во-вторых, это бывает быстрее, проще и дешевле, чем делать на местах.
Всего лабораторий у Хеликса три — в Петербурге, в Москве и в Екатеринбурге.

10

Есть ли вообще у Хеликса конкуренты в сфере лабораторных исследований?
Есть компания Инвитро, но, как оказалось, некоторые анализы они отдают друг другу на аутсорс. Так что всё соперничество очень условно, главное — результат.

11

12
Хранилище биоматериала. Кровь после выдачи результата неделю хранится в лаборатории. Другие биоматерилы — один день. Так что если вдруг что-то не так, всегда можно успеть перепроверить.

13
Экскурсию нам провела Ирина Ивановна Скибо, директор технологического департамента Лабораторной службы Хеликс.
Тот человек, который знает о лаборатории всё и тот, чья подпись стоит на всех результатах анализов.

14

15

16
А тут наша кровь продолжает путь. Первое, что с ней происходит — процесс маркировки пробирок. Тут считывается информация с qr-кода, клеится штрихкод. Он должен быть наклеен ровно и в правильном месте, чтобы все приборы его правильно считывали.
Нам тут же предложили в этом поучаствовать. Согласилась всего пара человек. «Ну вот, а говорили, что крови не боитесь!» — подтрунивали над нами сотрудники.
А я что, я не боюсь, я всё жду микроскопа.

17

18
Бактериологическую лабораторию проходим мимо и смотрим из-за стекла:

19
Нас так строго предупредили, чтобы мы не мешали людям работать, что я боялась хоть как-то потревожить сотрудников. Здесь они работают круглосуточно — 3 смены по 8 часов.

20
Путешествия нашей крови продолжаются=)
На этом этапе я уже начала понимать — никаких микроскопов и возни с пробирками мне не светит. Тут всё полностью автоматизировано!
Всё делают машины, а люди контролируют все процессы.
Например, есть специальный аппарат, который сам забирает кровь из пробирки, прокалывая крышку и размазывает их по стёклышку.
Это полностью автоматизированная система для приготовления и окраски мазков крови. Использование интеллектуального клинового метода дает возможность регулировать объем наносимого образца крови, величину угла размазывающего лезвия, скорость нанесения и время ожидания, благодаря чему получаются стандартизованные препараты для дальнейшего анализа. Штрихкодовая и цифровая маркировка, автоматически наносимая на слайд, исключает случайные ошибки.

21
Тут всё такое красивое и все такие красивые!

22

23
Кто-то спросил, а что будет, если пробирка, например, упадёт и разобьётся?
Так вот ответ — даже если она упадёт, то не разобьётся, так как сделана из пластика, а не из стекла. Крышка тоже не отлетит, надета она плотно и в процессе исследования не снимается — автомат лишь её прокалывает и берёт нужное количество крови.

24

25

26
Это небольшой шейкер — постоянно взбалтывает кровь:

27
После прогона крови на автомате, идет сортировка: что-то в выдачу, что-то в микроскопию.
Микроскопия — анализы попадают к врачу, который внимательно изучает их на компьютере

28
Никогда ещё анализы не были такими красивыми.

29

30
А вот и компьютер.
Раньше, говорят, все эти клеточки и состав крови считали вручную! А сейчас всё посчитает компьютер

31
Вожделенный микроскоп тут всё же есть. Если врачу будет необходимо проверить результаты, он будет в него смотреть:

32

33
Это полностью автоматические преаналитические системы, предназначенные для автоматизации лабораторных процессов. Позволяют управлять потоками образцов, обеспечивая их прослеживаемость в процессе проведения исследований. Данные машины выполняют функции сортировки, аликвотирования, открывания пробирок, а также их архивирования после завершения исследований.

34
Автомат так же запечатывает пробирки после проведения всех исследований и в уже в таком виде они отправляют на хранение:

35

36

37

38

39
А это автоматический диагностический прибор, используемый для диагностики аллергических и аутоиммунных заболеваний.
Благодаря уникальной технологии ImmunoCAP обнаруживает сверхнизкие концентрации IgE-антител и других показателей в малом количестве крови. На сегодняшний день это наиболее точная технология лабораторной диагностики аллергий. Используется в большинстве крупных диагностических лабораторий Европы и Северной Америки.

40
Если у человека аллергия на что-то, то этот прибор помогает обнаружить конкретный продукт, а не просто группу продуктов

41

42

А после мы отправились ужинать в грузинский ресторан и ждать результатов (ведь анализы нужно сдавать на голодный желудок и пора уже было подкрепиться). С тех пор мне постоянно хочется оджахури. Вот такая история.

Спасибо за компанию nau_spb, swoofe, svetty, 2dar, dimkagrigoryev, alder, michaelmilaev, digestlj, itditpspb.
И нашим прекрасным экскурсоводам, а так же очаровательной Юлии Конаковой, как могло не понравиться в Хеликсе, когда у тебя такие проводники? Кадры решают всё!

Что означают антитела M и G к коронавирусу, когда лучше сдавать тест на антитела, через сколько пропадают антитела к коронавирусу | НГС

Дмитрий Денисов говорит, что в таком случае для определения того, заразен ли пациент в настоящее время, то есть выделяется ли вирус как минимум через верхние дыхательные пути, необходимо выполнить ПЦР-исследование для определения возбудителя новой коронавирусной инфекции.

7. Можно ли считать повторным заражением ситуацию, когда весной человек сдал только тест на антитела, нашел G, но не делал мазок, а теперь снова заболел, у него и М, и G или просто положительный мазок?

Положительный результат теста на антитела типа IgG говорит о том, что организм встречался с вирусом, а положительный результат теста на антитела типа IgM свидетельствует об имеющемся либо перенесенном в недавнем прошлом заболевании. Основываясь на данной информации, можно предположить повторное заражение.

— Однако следует учитывать, на каких именно тест-системах весной проводилось исследование на антитела, так как качественных и высокоспецифичных тест-систем для определения IgG и IgM к коронавирусу нового типа на тот момент было мало, — говорит Дмитрий Денисов.

Андрей Поздняков считает, что теоретически можно так считать, но практически — нужно серьезно изучать с учетом анамнеза и параклинических данных предыдущего заболевания.

8. Насколько точное тестирование на антитела?

— Для тест-систем, определяющих антитела, существуют показатели чувствительности и специфичности. Как правило, под аналитической чувствительностью такой тест-системы понимают тот уровень антител, который можно достоверно отличить от возможного фонового разброса регистрируемого сигнала в контрольных образцах, то есть образцах, заведомо не содержащих исследуемых антител. В связи с этой особенностью теоретически всегда могут существовать положительные образцы, в которых концентрация исследуемых антител еще недостаточно существенна, чтобы быть зарегистрированной прибором в качестве положительного результата исследований, — описывает Андрей Поздняков.

Проверка на туберкулёз: какой метод выбрать?

Туберкулёз в России распространён настолько, что к сорока годам 70-90% жителей нашей страны инфицированы им. Это не значит, что они больны: после инфицирования иммунитет большинства людей справляется с бактерией. Вероятность заболеть составляет в среднем 8% в первые два года после инфицирования, затем постепенно снижается, и формируется приобретенный клеточный иммунитет. Среди взрослых чаще болеют люди ослабленные, живущие в плохих условиях, при недостатке света и свежего воздуха. Тем не менее, заразиться может абсолютно каждый из нас. Поэтому так важно проходить регулярные проверки на туберкулёз и проверять своих детей.

Зачем нужна прививка БЦЖ?

ВОЗ рекомендует массовую вакцинацию новорожденных против туберкулёза во всех странах, где эта болезнь распространена. Поэтому на 3-5 день после рождения, еще в роддоме, всем новорожденным бесплатно делают прививку БЦЖ. Но эта вакцина не защищает от инфицирования туберкулёзом. Её задача несколько иная. Если не привитый ребенок младше 2 лет будет инфицирован туберкулёзом, у него крайне высока вероятность развития туберкулезного менингита и генерализованных форм туберкулеза, которые очень быстро приводят к смерти. БЦЖ достаточно надёжно защищает ребенка именно от этих форм. Она также защищает детей от легочной формы туберкулеза, но уже менее эффективно.

Какие ещё прививки нужны детям до 2-х лет?

Проба Манту

Проба Манту ежегодно проводится всем детям до 7 лет. Это не прививка (!), а иммунологический тест, показывающий, есть ли в организме возбудитель туберкулеза. При этом внутрикожно вводится туберкулин — специфический белок, содержащий антигены человеческого и бычьего туберкулеза. Через 72 часа измеряется размер папулы. На результат реакции Манту может повлиять посещение сауны, долгое принятие ванны, бассейн и расчёсывание места введения пробы. Временный контакт с водой никак не влияет на результаты пробы Манту, поэтому мнение о том, что Манту нельзя мочить — миф.

Диаскинтест тест

Он проводится детям с 8 лет.  Также является кожной пробой. Но если в Манту используются антигены как человеческого, так и бычьего туберкулеза, то в диаскинтесте — только антигены туберкулеза человека. Диаскинтест гораздо более специфичен: реакция на него возникает, только если в организме есть активные бактерии туберкулеза. Проще говоря — если проба Манту положительная, это ещё ничего не значит: эта проба часто дает и ложноположительные реакции. А вот после диаскинтеста появилась реакция — это более серьёзный показатель.

Точность Манту составляет 50-70%, диаскинтеста — 90%.

Квантифероновый тест

Квантифероновый тест — один из новых методов диагностики туберкулёза по анализу крови. Он основан на определении в крови гамма-интерферона, который вырабатывают клетки в ответ на внедрение туберкулезной палочки. В отличие от Манту и диаскинтеста, квантифероновый тест не требует введения в организм никаких антигенов и бактерий. Кровь для исследования берут из вены. Результат готов через несколько дней, и его точность намного выше, чем у кожных проб. Тест будет положительным, только если человек действительно болен.

T.SPOT.TB («ти-спот»)

Этот метод диагностики туберкулеза по крови аналогичен квантифероновому тесту. Отличие в том, что квантифероновый тест определяет в крови гамма-интерферон, вырабатываемый в ответ на внедрение туберкулезной палочки, а Т-СПОТ определяет сами Т-клетки, которые вырабатывают гамма-интерферон на присутствие микобактерии туберкулеза. Оба теста одинаково чувствительны и информативны (до 97%), они чувствительнее диаскинтеста и намного чувствительнее реакции Манту. «Ти-спот» практически исключает ложноположительные и ложноотрицательные реакции, в то время как квантифероновый тест все-таки может давать ложноположительную реакцию, если во время сдачи крови человек был, например, болен ОРВИ.

Сравнительная характеристика четырех тестов на туберкулёз

МантуДиаскинтестКвантифероновый тестT.SPOT.TB
Точность50,00%90,00%97,00%97,00%
Оценка данныхСубъективнаяСубъективнаяОбъективнаяОбъективная
Ложноположительные результатыЧастоРедкоКрайне редкоНет
При скрытой форме туберкулезаНе достоверенНе достоверенДостоверенДостоверен
ПротивопоказанияМногоЕстьНетНет
Побочные реакцииЕстьРедкоНетНет
При ВИЧ и других иммунодефицитахНе информативенНе информативенИнформативенИнформативен
Способ исследованияКожный тестКожный тестАнализ кровиАнализ крови

ПЦР

Чтобы отличить активную форму туберкулеза от латентной, используется специфический тест — ПЦР (исследования мокроты на ДНК). Таким образом, диаскинтест, ти-спот и другие тесты позволяют определить, болен ли человек туберкулезом вообще (легочным или внелегочным), а ПЦР — болен ли он им в активной форме.

Флюорография

Всем взрослым с 15 лет в России рекомендуется раз в год проходить флюорографию. Детям с 15 до 17 лет разрешено выполнять Флюрографию, но это не отменяет постановку Диаскинтеста. Справку со свежим снимком требуют везде — даже при посещении ребенка в больнице. Флюорография — это скорее «коллективный барьер» на пути туберкулеза, чем метод выбора для индивидуальной проверки. Флюрография выявляет только легочные формы туберкулеза.

Если у вас остались вопросы по методам диагностики туберкулеза — позвоните нам: +7 812 331 00 00, мы ответим на них!


Читайте также:

Власти Москвы массово проводят тесты на антитела к коронавирусу. Зачем?

  • Олег Болдырев
  • Би-би-си

Автор фото, Sergei Fadeichev/TASS

Власти Москвы проводят массовое тестирование москвичей на антитела к новому коронавирусу. О программе забора образцов крови сообщил на прошлой неделе мэр Сергей Собянин: по его словам, каждую неделю в 30 поликлиниках столицы будут собираться до 70 тысяч анализов.

Конкретные последствия этого тестирования остаются туманными, но судя по обнаруженному документу, тем, у кого антитела найдутся, грозит самоизоляция. Как это сочетается с заявлениями мэра Собянина о том, что антитела свидетельствуют об иммунитете — непонятно.

Би-би-си попыталась выяснить, какую пользу может дать эта программа, и чьи тесты используются.

Что московские власти надеются выяснить?

Ответим словами московского мэра Сергея Собянина: «Мы будем точно знать, какая доля москвичей переболела коронавирусом и приобрела иммунитет, сколько человек инфицированы или имеют подозрение на коронавирус. И главное — какова реальная динамика распространения инфекции».

Рассказывая о начале программы на сайте mos.ru, столичный мэр подчеркивает, что тест на антитела дополнит картину, которую давали тесты собственно на ковид, которые собирали у тех, чьи симптомы проявлялись открыто. И он неоднократно употребляет слово «иммунитет».

Между тем вот именно с иммунитетом к новому коронавирусу все еще совсем далеко от ясности. И тесты на антитела эту ясность пока внести не могут.

Что такое антитела? Если их нашли у меня, значит я больна?

Антитела — свидетельство того, что ваш организм уже сталкивался с инфекцией. Как и почти со всем, что связано с новым коронавирусом, сейчас нельзя сказать точно, какую именно роль играли антитела в общем ответе организма на Covid-19. Являлись ли они просто реакцией на встречу с вирусом или же имеют защитную функцию — неизвестно.

Но, анализируя тест, обращают внимание на присутствие иммуноглобулинов двух типов — IgM и IgG. Упрощая, можно сказать, что присутствие IgM говорит о том, что инфекция была перенесена недавно, IgG — о том, что со времени заражения уже прошло какое-то время.

Вот как эту разницу объясняет Михаил Фаворов, эпидемиолог и президент американской компании DiaPrep System: наличие маркера IgG говорит о том, что был контакт с вирусом. А IgМ является маркером периода болезни. «Если у Вас оба маркера (IgG, IgМ), то вы переболели (большинство без симптомов), и это было недавно (1-3 месяца, но у некоторых до 6-ти). Если у вас только IgG, то Вы уже реконвалесцент (выздоровевший — ред.) и могли встретиться с вирусом какое-то время назад», — пишет Фаворов.

Что ждет тех, у кого скрининг выявит антитела?

В заявлении мэра говорится и о том, что «потенциальные носители инфекции должны будут брать больничный и проходить самоизоляцию». Как конкретно это будет определяться, не говорилось. Но некоторую ясность внес документ, появившийся на сайте «Федерации лабораторной медицины». Это — решение «Клинического комитета по Covid-19» от 12 мая.

Судя по решению «Клинического комитета», власти нервирует любое обнаружение антител. Как тех, что свидетельствуют о недавно перенесенной болезни, так и тех, что относятся к сравнительно давнему иммунному ответу.

В решении «Клинического комитета» содержится таблица интерпретации диагностических тестов. Данные по маркерам IgM равные или больше 1,0 и IgG с любым значением будут говорить о «стадии иммунологического ответа на вирус SARS-CoV-2». И могут повлечь за собой самоизоляцию на две недели, а «с учетом особенностей клинического процесса до 3 недель». Показатели IgM меньше 1,0 и IgG равных или больше 10,0 означают «наличие иммунологической памяти на контакт с вирусом SARS-CoV-2» и, если нет информации о ранее перенесенной новой коронавирусной инфекции, тоже могут означать самоизоляцию на 2 недели.

И лишь только низкие показатели (IgM меньше 1,0 IgG меньше 10,0 ) говорят об «отсутствии контакта с вирусом SARS-CoV-2 или отсутствии антител в диагностически значимом количестве». Тем у кого такие результаты, рекомендовано «соблюдение общих правил по предотвращению инфицирования».

Би-би-си попыталась связаться с президентом «Федерации лабораторной медицины», руководителем отдела лабораторной диагностики института им. Склифосовского Михаилом Годковым, который значился одним из участников совещания 12 мая. Годков был недоступен, а вскоре документ исчез с сайта Федерации.

Вскоре после публикации этой статьи департамент здравоохранения Москвы заявил, что никаких мер, о которых повествует таблица интерпретации диагностических тестов, не существует. «Информация не соответствует действительности. Якобы утвержденных алгоритмов, о которых говорится в материалах, не существует. Пациентам, у которых выявлены иммуноглобулины G, говорящие об иммунитете к вирусу, никакие постановления или предписания о самоизоляции не выдаются», — утверждает департамент.

Просьбы Би-би-си уточнить происхождение документа и суть принятых решений, направленные в депздрав перед публикацией статьи, пока ожидают ответа. Интересно, что слово «алгоритм» не использовано в этой статье, но содержится как раз в упомянутом решении.

Так я не понял. Если у меня нашли антитела, то я уже не заболею ковидом?

Вопрос, что называется, на миллиард долларов, если учесть экономические потери от пандемии. Но ответить на него однозначно пока никто не может. «Есть антитела просто как свидетель того, что контакт с инфекцией был, но они не обладают нейтрализующей активностью», — подчеркивает автор одного из зарегистрированных недавно тестов на антитела, российский ученый Григорий Ефимов из НМИЦ гематологии минздрава РФ.

Специалисты предполагают (однако и это не 100-процентная уверенность), что наличие достаточной концентрации антител в первые недели после выздоровления существенно уменьшает шансы на повторное заражение. Однако как долго они сохраняют защитную функцию, неизвестно. «В настоящий момент нет никаких свидетельств того, что люди, которые выздоровели от Covid-19 и имеют антитела, защищены от повторного инфицирования», — заявила Всемирная организация здравоохранения.

В исследованиях пациентов, переболевших другой коронавирусной инфекцией, атипичной пневмонией SARS 2003 года, отмечалось, что с годами антитела к вирусу исчезали и организм переставал узнавать его. Есть и другие коронавирусы, иммунитета к которым наш организм не приобретает.

Ой. Еще коронавирусы? А тесты хорошо отличают одни от других?

С учетом нового 2019-nCoV, коронавирусов, способных заразить человека, сейчас известно семь. Взять хотя бы банальную простуду — ее тоже могут вызывать коронавирусы, только других видов.

Часть проблемы с тестированием — в том, что иммунный ответ на прочие коронавирусы и на другие инфекции может давать ложное указание на наличие антител к 2019-nCoV, снижая, таким образом, специфичность теста. Эти ложные срабатывания на другие следы завышают показатель ложно-положительности в тесте.

Его недостаточная чувствительность, напротив, упускает тех, кто действительно носит в себе следы инфицирования новым коронавирусом. А значит, будет много ложно-отрицательных. В идеальном тесте не должно быть ложно-положительных или ложно-отрицательных срабатываний.

Но идеальных тестов нет. А что считать хорошим тестом?

Уже через несколько недель после начала пандемии в разных странах стали появляться тесты на антитела к новому вирусу. И специфичность, и точность многих из них не выдерживали критики. Опрошенные специалисты сходятся в том, что показатели чувствительности и специфичности ниже 96-94% нельзя считать приемлемыми.

Проблема еще и в том, что многие производители не указывают отдельных показателей по ложно-положительным и ложно-отрицательным срабатываниям в своей продукции. Да к тому же рекламируемая точность отнюдь не всегда является реальной. Но даже если точность и не дотягивает всего три-четыре процента до абсолютной, простор для ошибки статистически весьма велик, подчеркивают те, кто скептически относятся к идее массового тестирования на антитела.

95 из 100? Какой может быть скепсис?

Спросите математиков. Объяснение упирается в концепцию Положительной прогностической ценности (Positive Prediction Value): в огромной группе исследуемых с низким количеством реально переболевших (предполагают, что это все-таки считаные проценты от общего числа жителей) даже небольшие доли погрешности в тестах в итоге очень сильно размывают определенность результата.

В условной группе из 100 тысяч тестируемых с 1% переболевших тест с 95-процентными показателями чувствительности и специфичности приведет к тому, что вероятность верного результата у каждого протестированного сведется всего к 16%. Специалисты подчеркивают, что такой тест точно нельзя делать тем, кто, скажем, отправляется работать в «красную зону», надеясь, что выявленные антитела к коронавирусу гарантируют им защиту.

Проблема в том, что для таких критических расчетов хорошо бы представлять процент переболевших. А московские власти говорят, что не представляют. И поэтому делают это массовое обследование, так как другого способа выяснить нет. Круг замыкается.

Хватит теории. Чем тестируют москвичей в этом скрининге?

Еще один хороший вопрос без четкого ответа. Несколько опрошенных специалистов в Москве уверены, что речь идет о двух тестах китайской компании Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd., продукцию которой в России представляет компания «Миндрей медикал рус». Об этом свидетельствует и «Решение клинического комитета». Документ говорит «о запуске тестирования на количественное определение IgM- и IgG-антител к SARS-CoV-2 методом ИХЛА (иммунохемилюминисцентного анализа — ред.) с использованием оборудования Mindray».

Две ее системы для определения антител по маркерам IgM и IgG методом иммунохемилюминисцентного анализа были зарегистрированы Росздравнадзором 7 мая. Кроме этого должны были быть закуплены анализаторы крови этой же компании. О закупке анализаторов для скрининга московские власти сообщали в начале мая. Однако поставщиков не называли.

Но специалисты указывают, что большинство других тест-систем не нуждаются в особом, за пределами стандартного, оборудовании для анализа, а тесты «Миндрей» собираются в кассеты, которые затем вставляются в анализатор этой фирмы. Правда, это предположение не согласуется с заявлением мэра Москвы, который сказал, что тестирование будет идти методом иммуноферментного анализа. Такой анализ обычно не требует каких-то необычных анализаторов для исследования взятых образцов крови.

Департамент здравоохранения столицы переадресовал вопросы о производителе тест-систем в московский оперативный штаб по борьбе с коронавирусом. На момент публикации ни оперштаб, ни «Миндрей медикал рус» не ответили на вопрос о том, действительно ли эти тесты обеспечивают массовую проверку москвичей. В системе госзакупок не удалось обнаружить никаких контрактов, связанных с этим.

Хм. Ну, предположим «Миндрей». И как он?

Как говорится, все сложно. Показатели в англоязычной документации на оба теста дают чувствительность в 98% и специфичность в 96%. Но в появившихся в сети снимках русскоязычной сопроводительной брошюры показатели иные — 97% чувствительности и 93,1% — специфичности.

Екатерина Померанцева, научный консультант центра генно-репродуктивной медицины Genetico, только что зарегистрировавшего свой тест на антитела к коронавирусу, находит это странным. Она считает, что с какой-то погрешностью теста можно мириться, но для этого она должна быть точно известна. «Если ты очень хорошо знаешь, какая ошибка у системы, то ты можешь получить какую-то цифру (на исследованиях — ред.), а потом просто вычесть эти четыре процента из полученного результата. Для этого важна твоя точность представлений об этом тесте. Поэтому очень большой вопрос, насколько точно мы знаем аналитические характеристики этого теста», — говорит она.

Запрос в представительство «Миндрей медикал рус» о том, с чем может быть связано это изменение и проходили ли тесты независимую оценку, на момент публикации остается без ответа. Такая независимая оценка сейчас в ходу.

Президент DiaPrep System Михаил Фаворов сообщил, что его компания недавно исследовала шесть экспресс-тестов на антитела к коронавирусу по заказу властей «одной из стран бывшего СССР». Три из них, по словам специалиста, полностью провалились — не смогли выявить антитела вообще. И это — несмотря на заявленные в документации высокие показатели, сравнимые с теми, что дает китайская компания.

О расхождениях между заявленными в документациях и реальными показателями некоторых изученных на заказ тестов сказала и Екатерина Померанцева из Genetico.

Если на самом деле точность теста ниже, то чем мы рискуем? И для чего это вообще?

Этот вопрос впрямую связан с тем, какие цели ставят московские власти. Во-первых, Сергей Собянин говорит о принятии «управленческих решений, связанных с планированием работы медицинской системы и сохранением либо смягчением действующих ограничений».

«Это необходимо, чтобы адекватно принимать решения, связанные с ограничительными мерами, работой предприятий сферы промышленности, строительства, науки, торговли, услуг и так далее, чтобы мы понимали, куда мы идем, на какой стадии сложности находимся, оперативно и адекватно принимали необходимые меры», — сказал он в одном из недавних интервью.

Би-би-си попросила московские власти пояснить, какие конкретно решения могут быть связаны с теми или иными численными показателями московского скрининга, но ответа пока не получила. Официальные заявления Сергея Собянина пока ничего не проясняют: до сих пор все решения по ослаблению карантина ставились в зависимость от уменьшения динамики заражений на ежедневной основе, а новые данные об уже перенесенных заболеваниях не сопоставляются с ними напрямую.

В любом случае, и тут Москва пока ведет себя более консервативно, чем другие регионы. Какие конкретно эпидемиологические выводы власти намерены сделать на основе массового скрининга, пока неясно. Речь точно не идет о каких-либо дополнительных послаблениях или расширенных свободах для тех, у кого антитела найдут, и никаких «паспортов переболевших» этот скрининг не подразумевает.

Скорее наоборот. Из «таблицы интерпретации результатов» следует, что ложно-положительные срабатывания теста будут означать неудобства для тех, кого ошибочно могут отправить на карантин. Правда, Собянин оговаривается, что таким людям будут сделаны стандартные ПЦР-тесты на коронавирус. Однако и их результатов, как показывают два месяца эпидемии, иногда надо ждать долго и они также не точны.

Собянин говорит, что Москва в таких тестах — впереди планеты всей. Это так?

Норвежец Хенрик Ярлов ведет открытый подсчет всех массовых тестирований на антитела к коронавирусу. Пока что в его базе данных из 74 экспериментов с тестированием упоминаний о московском нет, а самой массовой следует считать программу тестирования в Испании с упоминанием о 60 тысячах участников. Если Москва обеспечит хотя бы половину из заявленных 70 тысяч в неделю до конца мая, это исследование будет самым значительным по масштабу среди других.

Данные о пропорции положительных результатов в закончившихся обследованиях варьируются чрезвычайно — в одном из экспериментов в Италии, как следует из данных сводной ведомости, у 50% обследованных были найдены антитела. Подавляющее большинство проведенных кампаний по тестированию показывают куда меньшее количество переболевших — от долей процента до 3-4%.

Однако объяснений и трактовок полученным результатам масса, и многие комментаторы говорят о неправильной методологии и сомнительном качестве самих тестов. Ясности пока очень мало. Гарантировать, что московский скрининг обогатит мировые знания о заболеваемости коронавирусом, никто пока не берется.

Каких-либо конкретных решений, которые бы проистекали из тестирования на антитела, ни в одной стране пока не принимали. Впрочем, власти в разных странах не исключают, что они могут помочь. В Великобритании замминистра здравоохранения заявил, что тесты могут стать поворотным моментом в борьбе с коронавирусом. Это произошло после того, как Public Health England — одно из исполнительных подразделений минздрава — одобрило к использованию тест на антитела производства компании Roche. Однако пока правительство не закупало этот тест для массового использования. Британские власти «обожглись» на закупке огромной партии экспресс-тестов на антитела, точность которых оказалась очень низкой.

В конце апреля тесты на антитела начались в двух городах Южной Кореи. Как и в России, представители системы здравоохранения заявили, что исследование поможет определить процент переболевших коронавирусом. Заявлено, что программу обследования на антитела, вероятно, распространят в масштабах всей страны, но о конкретных последствиях тоже пока не говорят.

Так все-таки надо обследовать огромные группы людей или пользы в этом нет?

Многие из исследований на антитела к коронавирусу за рубежом проводились на ограниченных социальных или профессиональных группах, иногда числом всего в несколько сотен человек. Претензии к одному из первых и широко обсуждавшихся исследований такого рода — тестированию 3300 жителей графства Санта-Клара в Калифорнии в апреле — сводились к критике выборки тестируемых и доли ложно-положительных результатов в использованном тесте.

При этом многие утверждают, что именно ограниченное тестирование в отдельных группах — скажем, среди врачей — может дать какую-то полезную пищу для размышлений. Автор одной из тест-систем, недавно зарегистрированных и используемых в коммерческой лаборатории, Григорий Ефимов из НМИЦ гематологии говорит, что для полноценных выводов не подходят, к примеру, данные коммерческих лабораторий.

«Там выборка не будет репрезентативной — пришли те люди, которые имеют основание думать, что они переболели, и это будет очень сильно искажать статистику. Для того, чтобы получать настоящую статистику, надо действительно брать случайных людей», — считает он. Ефимов не видит вреда в том, что, пусть и с какой-то вероятностью статистических ошибок, такое массовое тестирование состоится.

Михаил Фаворов из DiaPrep System говорит, что системного подхода к тестированию на антитела нет. «Популяционные исследования иммунитета к респираторным вирусам — хорошо известная вещь. Они должны проводиться на основе выборки групп населения и методов научно обоснованной статистики. Но это должны делать специалисты аналитической эпидемиологии, которых в России не готовили даже в позднейший период, не говоря уж о временах СССР». Он подчеркивает необходимость создания национального органа по сертификации тестов на антитела, но говорит, что это вступит в противоречие с коммерческими и научными интересами тех, кто заинтересован в продвижении своих разработок.

В условиях беспрецедентной пандемии безусловную ценность московского скрининга на антитела отмечает вирусолог, доктор биологических наук Алексей Аграновский. «Это большие числа. Это все же дает картину того, сколько человек переболели в популяции. И другого способа получить ее не существует. Пускай даже и будет ошибка в три-четыре процента, я не считаю ее фатальной. Массовый скрининг даст возможность, принимая во внимание большую надежность иммунологического теста в сравнении с ПЦР (тот самый мазок у больных в активной фазе — ред.), установить реальный процент переболевших, эффективность принятых мер. Что нам ждать, насколько высока прослойка иммунной защиты в популяции. Эти данные можно получить только «в поле», их нельзя вычислить».

Но в скрининг я, по статистической вероятности, не попаду. А что у частных лабораторий, чьи тесты лучше?

В России зарегистрировано около 20 тестов на антитела к коронавирусу, как иностранных, так и российского производства. Их авторы и владельцы, естественно, подчеркивают надежность и точность своей технологии. К примеру, на совещании по генетическим исследованиям с президентом Путиным директор Института молекулярной биологии им. Энгельгардта академик Макаров заявил, что в глобальном исследовании тест-систем на антитела к коронавирусу «была и наша система. Хочу отметить, что она заняла хорошее место, первое-второе поделила».

Никаких ссылок на это исследование академик не привел, и понадобилось некоторое время, чтобы понять, что речь идет об антигенах, переданных из университета Маунт-Синай в США в Россию, на которых ИМБ теперь делает свои наработки.

Помимо бесплатного московского скрининга услуги по выявлению антител к коронавирусу предлагают несколько коммерческих лабораторий («Хеликс», Genetico, «Инвитро», «Гемотест», KDL, GMS Moscow, Hadassa). Не все из них указывают, чьи тесты используются.

Оплатив такой тест, вы сможете с какой-то вероятностью утверждать, что переболели новым коронавирусом. Гарантировать, что вы не заболеете им снова, сейчас не возьмется ни один из многих тысяч ученых, работающих по всему миру над разгадкой тайн 2019-nCoV.

При участии Николая Воронина и Светланы Рейтер

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с вашим системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с вашим системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файлах cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Helix получает расширенное разрешение на использование в экстренных случаях для неконтролируемого самостоятельного сбора на месте и бессимптомного скрининга с помощью теста Helix® COVID-19 Test

САН-МАТЕО, Калифорния, 26 октября 2020 г. / PRNewswire / — Helix, ведущая компания в области популяционной геномики, объявила о получении расширенного разрешения на использование в чрезвычайных ситуациях (EUA) от США.Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для теста Helix COVID-19. Благодаря этому расширению люди теперь могут самостоятельно собирать образцы без надзора со стороны медицинского работника. Кроме того, тест теперь показан для использования у бессимптомных лиц для скрининга или популяционного тестирования.

Устраняя необходимость в наблюдении за сбором у медицинского работника, как это в настоящее время требуется для большинства тестов на COVID-19, организации, использующие тест Helix ® COVID-19, получат значительно большую гибкость в том, как они встают и управляют участками тестирования. и центры сбора.Это также помогает снизить затраты на сбор и решить проблему нехватки клинического персонала по всей стране, чтобы обеспечить направление этих ресурсов туда, где они больше всего нужны.

«Масштабирование быстрого и надежного тестирования на COVID-19 — это не просто научная или технологическая проблема — это еще и серьезная логистическая проблема», — сказал Марк Стэпли, генеральный директор Helix. «Это расширение нашего EUA для обеспечения возможности самостоятельного сбора на месте помогает нашему правительству, образовательным учреждениям и партнерам-работодателям значительно оптимизировать свои операции, снизить затраты на сбор и более оперативно расширить доступ к тестированию на COVID-19.«

Благодаря расширенному EUA Helix также становится одной из немногих лабораторий, уполномоченных проводить тестирование бессимптомных лиц на COVID-19, что является важной частью любой стратегии безопасного открытия школ и рабочих мест. Однако для тестирования бессимптомных людей требуется высокочувствительный тест. Недавний отчет от FDA, сравнивающий более 75 других тестов, показал, что тест Helix ® COVID-19 является одним из самых чувствительных на рынке.

«Возможность широкого тестирования людей независимо от симптомов имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы мы могли предотвращать и смягчать вспышки и выявлять людей как можно раньше в процессе заражения», — сказал д-р.Джеймс Лу, доктор медицинских наук, соучредитель и президент Helix. «Кроме того, снижение барьеров для тестирования позволяет нам охватить некоторые из наиболее уязвимых и недостаточно обслуживаемых групп населения в США».

Тест Helix ® COVID-19 является частью комплексной тестовой системы Helix, которая включает в себя неинвазивный набор для сбора и обработку образцов в лаборатории высокой сложности Helix, сертифицированной CLIA, аккредитованной CAP в Сан-Диего. , время обработки на следующий день с момента получения образцов и возврата результатов заказывающему медицинскому работнику, испытуемому лицу и органам общественного здравоохранения.С момента запуска этой системы Helix поддерживает средний срок обработки 14 часов с момента получения образца в лаборатории Helix.

Сегодня Helix предоставляет услуги тестирования на COVID-19 системам здравоохранения, работодателям, правительствам, розничным аптекам и другим организациям по всей стране. Благодаря этим дополнительным показаниям нынешние и будущие партнеры Helix значительно повысили гибкость в развертывании тестирования в своих сообществах.

Тест Helix ® COVID-19 был разрешен FDA в соответствии с EUA для использования в уполномоченных лабораториях.Этот тест не был одобрен или одобрен FDA. Этот тест был разрешен только для обнаружения нуклеиновой кислоты от SARS-CoV-2, но не для каких-либо других вирусов или патогенов. Этот тест разрешен только на период действия заявления о существовании обстоятельств, оправдывающих разрешение экстренного использования диагностических тестов in vitro для обнаружения и / или диагностики COVID-19 в соответствии с разделом 564 (b) (1) Закона, 21 U.S.C. § 360bbb-3 (b) (1), если авторизация не будет прекращена или отозвана раньше.

Дополнительная информация, включая важную информацию о тестах и ​​ограничениях, доступна на сайте helix.com/COVID .

О компании Helix

Helix — ведущая компания в области популяционной геномики, работающая на стыке клинической помощи, исследований и геномики. Его сквозная платформа позволяет системам здравоохранения, медико-биологическим компаниям и плательщикам продвигать геномные исследования и ускорять интеграцию геномных данных в клиническую помощь. Основанная на одной из крупнейших в мире лабораторий секвенирования нового поколения CLIA / CAP и ее патентованном анализе Exome + ®, Helix поддерживает все аспекты популяционной геномики, включая набор и участие, клинически действенный скрининг болезней, возврат результатов, а также фундаментальные и трансляционные исследования.В ответ на кризис общественного здравоохранения, связанный с COVID-19, Helix запустила чувствительную и масштабируемую систему сквозного тестирования COVID-19 для удовлетворения потребностей систем здравоохранения, работодателей, правительств и других организаций по всей стране. Узнайте больше на www.helix.com.

ИСТОЧНИК Helix

Ссылки по теме

http://www.helix.com

Избирательная модуляция химических и электрических синапсов нейронных сетей Helix в процессе развития in vitro | BMC Neuroscience

Экспериментальные данные, собранные MEAs и представленные в этой работе, были получены для 8 культур Helix , отслеживаемых через 6, 24, 36, 48, 54 и 72 часа после посева.Как объяснялось в разделе «Методы», мы рассматривали 3 культуры, обработанные серотонином (5-HT), 2 культуры с высоким содержанием внеклеточного калия (KCl) и 3 в качестве контроля, то есть без какого-либо лечения.

Полисинаптические цепи Helix демонстрируют зависящую от лечения длительную активность

Когда нейроны Helix культивируются in vitro, они не проявляют никакой спонтанной электрической активности [10]. Мы проследили развитие (от 6 до 72 часов после посева) 3 культур, состоящих из 12 B2 и 4 C1 нейронов, расположенных в конфигурации, изображенной на рисунке 1A.В каждый момент времени мы регистрировали 30 минут спонтанной активности: в 3 нестимулированных культурах не наблюдалось никакой всплесковой активности. Чтобы проверить работоспособность сетей и эффективное наличие синаптических связей, мы провели электрическую стимуляцию в час 72, и . Выбранные клетки были индивидуально пронзены и стимулированы импульсом тока, амплитуда которого была достаточной для преодоления порога возбудимости. В этих условиях мы могли наблюдать сетевую активность, в которой участвовали все нейроны сети (данные не показаны).

Рисунок 1

Схематическое изображение сетевой организации и исходных данных. ( A ) Примерная схема размещения нейрона на МЭБ. Красные и синие квадраты указывают положение ячеек C1 и B2 соответственно. Число внутри квадратов указывает положение электрода в схеме MEA. ( B ) 1 секунда активности от микроэлектрода с нейроном C1. ( C ) 1 секунда активности, исходящая от микроэлектрода с нейроном B2.

Чтобы вызвать электрофизиологическую активность в сетях Helix , мы химически обрабатывали такие культуры с помощью двух протоколов стимуляции в каждый момент времени регистрации: i) Повышение внеклеточной концентрации калия (KCl) с 5 мМ до 65 мМ, что приводит к общая деполяризация мембранных потенциалов клеток; ii) доставка серотонина (5-HT) в концентрации, равной 20 мкМ, которая избирательно деполяризует нейроны B2. Подробности этих протоколов описаны в разделе «Методы».

На рис. 2 показаны качественные результаты для одной культуры, обработанной KCl. Каждый горизонтальный блок рисунка представляет собой момент времени записи (т.е. 6, 24, 36, 48, 54, 72 часа). Три растровых графика для каждого блока показывают одну минуту электрофизиологической активности до, во время и после доставки KCl. Красные и синие линии относятся к нейронам C1 и B2 соответственно. Первое наблюдение заключается в том, что KCl индуцировал временную деполяризацию сети, которая длилась не более 1 минуты: нейроны быстро деполяризовались с задержкой 825 ± 43 мс от доставки KCl.В результате устойчивой деполяризации мембраны сети переходили в состояние покоя перед вымыванием, возможно, за счет инактивации потенциалзависимых натриевых каналов. Фазы до и после стимуляции KCl в основном характеризовались отсутствием активности: до стимуляции сети Helix всегда полностью молчали (см. Также график IFR, представленный на рисунке 3A). После промывки сеть перешла в состояние покоя, в котором не было зарегистрировано никакой активности: время от времени обнаруживались лишь небольшие колебания в нейронах B2, как показано на рисунке 3A.Основное наблюдение на этих растровых графиках и на кривых IFR за 24–72 часа разработки заключается в том, что KCl не вызывает постоянной активности в сети. Это переходное поведение было постоянным для всех периодов записи во время разработки.

Рисунок 2

Пример культуры Helix , обработанной с помощью приложений KCl. Каждый блок представляет собой момент времени записи (т.е. 6, 24, 36, 48, 54, 72 часа после нанесения покрытия).В первом столбце показано развитие ветвлений нейритов (шкала 200 мкм). Три столбца растровых графиков показывают одну минуту электрофизиологической активности непосредственно до, во время и после обработки KCl. Красные и синие линии обозначают нейроны C1 и B2 соответственно. Шкала шкалы 10 с.

Рисунок 3

Характеристики срабатывания сетей Helix . Мгновенная скорость стрельбы (IFR) ( A , B ) и средняя скорость стрельбы (MFR) ( C , D ), усредненные по всему набору данных для культур, обработанных KCl (A, C) и 5 -HT (B, D).Нейроны C1 и B2 обозначены красным и синим цветами соответственно.

И наоборот, длительная нейронная активность в сетях, обработанных 5-HT, не наблюдалась. На рис. 4, в графическом исполнении с тем же рисунком, что и на рис. 2, показан пример сети Helix , обработанной с помощью 5-HT. За исключением растровых графиков первого блока (первый и третий столбцы, т. Е. До и после стимуляции 5-HT, соответственно), нейроны продолжали активироваться после вымывания (третий столбец) и через несколько часов (первый столбец). ).Доставка 5-HT, по-видимому, запускает нейронные сетевые цепи в колебательное состояние, которое сохраняется в течение длительного времени во время развития сети. Мы оценили частоту квазипериодического поведения ячеек C1 и B2, вычислив обратную величину ISI. После перехода в периодический режим мы обнаружили, что нейроны C1 активировались с частотой от 0,2 Гц во время фазы до стимуляции до 0,6 Гц во время стимуляции, а затем снижались до 0,3 Гц в фазе после стимуляции.Эти значения сохранялись во время развития сети. В2-нейроны показали частоту срабатывания около 1 Гц во время периодического режима. Чтобы оценить, была ли активность стрельбы периодической, мы вычислили коэффициент вариации (CV) ISI. Установив произвольный порог на 0,2, мы считали квазипериодическими те нейроны, у которых CV меньше 0,2. Дополнительный файл 1 показывает тенденции как CV, так и частоты. Сети, обработанные KCl, никогда не проявляли квазипериодического поведения, так как CV всегда был больше 0.2.

Рисунок 4

Пример культуры Helix , обработанной с помощью приложений 5-HT. Каждая линия представляет собой момент времени записи (т.е. 6, 24, 36, 48, 54, 72 часа после нанесения покрытия). В первом столбце показано развитие ветвлений нейритов (шкала 200 мкм). Три столбца растровых графиков, как на рисунке 2. Красные и синие линии обозначают нейроны C1 и B2 соответственно. Шкала шкалы 10 с.

Чтобы лучше проанализировать механизмы, лежащие в основе длительной активности, индуцированной 5-HT, мы дополнительно охарактеризовали сети Helix , чтобы оценить, связано ли это событие с изменениями возбудимости клеток или, альтернативно, с модификациями морфологической и функциональной связности. .

Сети Helix демонстрируют стабильную динамику во время развития

Следуя подходу, используемому для характеристики in vitro развития кортикальных нейронов млекопитающих, связанных с MEAs [12, 13], мы сначала количественно оценили среднюю частоту возбуждения (MFR) и межспайковый интервал. интервал (ISI). На рис. 3A и B показаны тренды IFR нейронов C1 (красный) и B2 (синий). При сравнении тенденций IFR культур, обработанных KCl (рис. 3A) и 5-HT (рис. 3B), основное различие заключалось в полном отсутствии электрофизиологической активности в нейронах C1 и B2 до стимуляции KCl.Напротив, 5-HT индуцировал низкочастотную (<5 Гц) базовую активность, особенно в клетках B2. Во время развития заметных различий замечено не было: в культурах, стимулированных KCl, мы наблюдали быстрое повышение активности сразу после стимуляции, которое длилось менее 1 минуты. Как в нейронах C1, так и в B2, IFR достиг максимального значения 20 Гц. В случае стимуляции 5-HT IFR после резкого увеличения оставался стабильным на протяжении всей фазы стимуляции. При разработке принципиальных отличий не наблюдалось.Нейроны C1 и B2 запускались очень регулярно: нейроны B2 запускались с большей частотой, чем C1, и эта активность сохранялась до вымывания. Впоследствии, после короткого переходного процесса (от 2 до 5 минут), характеризующегося периодом молчания, нейроны B2 спонтанно возобновили работу. В этой постстимульной фазе динамика, демонстрируемая сетями, обработанными KCl, была более нерегулярной: нейроны C1 всегда находились в состоянии покоя во время развития, тогда как нейроны B2 демонстрировали пик активности в 48 th час.Затем IFR замедлился на 54 -м часе до нуля на 72 -м часу .

Количественно оценив количество всплесков, генерируемых сетями, стимулированными KCl или 5-HT во время разработки, мы вычислили MFR, как показано на рисунках 3C и 3D. При усреднении по временному окну 30 минут пики MFR для нейронных сетей Helix , обработанных KCl, и 5-HT достигли значений 0,4 и 1,5 ударов в секунду, соответственно. В частности, мы обнаружили, что максимальное значение MFR для сети, обработанной 5-HT, равно 1.16 ± 0,16 (нейроны B2) и 1,48 ± 0,27 (нейроны C1) ударов в секунду во время фазы стимуляции в временной точке 72 nd часов. Для манипуляции с KCl пик активности возбуждения 0,29 ± 0,41 (нейроны B2) и 0,32 ± 0,45 (нейроны C1) уд / с был достигнут через 48 часов после посева в фазе после стимуляции. Интересно, что значения MFR были статистически одинаковыми во время разработки (рисунки 3C и D), что позволяет предположить, что пиковая активность была стабильной, хотя возможности подключения к сети менялись и развивались (см., Рисунки 2, 4 и 7).

Чтобы лучше количественно оценить возможные изменения в динамике сети во время развития in vitro, мы вывели распределение интервала между спайками (ISI), как показано на рисунке 5. На рисунках 5A и B показаны распределения ISI относительно фаз стимуляции (т. Е. 5- HT (серый), KCl (черный)) для нейронов C1 и B2 соответственно. Мы обнаружили, что KCl индуцировал более быструю пиковую активность, чем 5-HT: нейроны C1 (Рисунок 5A) и B2 (Рисунок 5B) при стимуляции KCl (черная линия) показали основной пик ISI меньше 0.5 с, тогда как обработка 5-HT (серая линия) сдвинула такие пики для нейронов C1 и B2 в сторону 1 с. Латентность основного пика (предпочтительный интервал между спайками) не показала статистически значимых различий во время развития как для нейронов C1 и B2, так и для обеих стимуляций (см. Фиг. 5C и D). Таким образом, сравнивая культуры, обработанные KCl и 5-HT, мы обнаружили статистически значимое различие во временном пике ISI (Kruskal-Wallis, непараметрический тест, P <0.01).

Рисунок 5

Характеристика интервала между спайками (ISI) сетей Helix . ( A , B ) Распределение ISI относительно фаз стимуляции для нейронов ( A ) C1 и ( B ) B2. Обработка 5-HT и KCl обозначена серым и черным цветами соответственно. Ширина бина = 20 мс. ( C , D ) Положение временного пика распределений ISI относительно нейронов C1 ( C ) и B2 ( D ) соответственно.(Краскал-Уоллис, непараметрический тест, P <0,01)

Синаптически изолированные нейроны

Helix не обнаруживают изменений возбудимости при лечении 5-HT и KCl

Для оценки изменений, вызванных 5-HT или KCl Что касается возбудимости нейронов, мы измерили биофизические параметры культивируемых изолированных нейронов C1 и B2, используя методы внутриклеточной записи. К этим клеткам применялись те же процедуры культивирования и обработки, которые описаны для устройств MEA.Мы проанализировали как спонтанную, так и возбуждающую активность, вызванную стимулом деполяризации, примененным через 6 часов после нанесения покрытия, до обработки и вскоре после вымывания обработки (рис. 6А). Более того, те же клетки снова регистрировали через 24 часа после посева, чтобы проверить наличие долгосрочных эффектов. Как правило, через 6 часов после посева нейроны B2 демонстрировали низкочастотную спонтанную активность до лечения ( n = 8 в каждой группе; фигура 6B). Эти клетки сильно увеличили свою активность возбуждения после вымывания 20 мкМ серотонина, нанесенного в течение 10 минут, переключив их скорость возбуждения с 0.От 06 ± 0,06 до 0,72 ± 0,14 импульсов / с (против 0,12 ± 0,07 всплесков / с в контрольной группе; P <0,001, апостериорный тест Бонферрони ). После вымывания раствора с высоким содержанием KCl значительных изменений не наблюдалось, что подтверждает, что вымывание полностью снижает активность, индуцированную калием. Те же клетки снова тестировали через 24 часа, и во всех экспериментальных группах не было обнаружено спонтанной активности. С другой стороны, нейроны C1 всегда были полностью безмолвными (рис. 6C).

Рисунок 6

Оценка Helix Возбудимость C1 и B2. ( A ) Типичные электрофизиологические записи нейронов C1 и B2 до и после применения 5-HT. Измерялись как спонтанная активность ( B , C ), так и реакция на шаг деполяризующего тока (0,5 нА в течение 10 секунд; D , E ). ( B ) В нейроны B2 показали значительное увеличение активности спонтанного возбуждения только после обработки 5-HT.Через 24 часа после посева никакой активности не наблюдалось. Напротив, нейроны C1 ( C ) молчали во всех экспериментальных группах. Во время электростимуляции B2 демонстрировал аналогичную частоту возбуждения ( D ), в то время как более высокая частота возбуждения вызывалась в нейронах C1 только после применения 5-HT. ( E ) Сопоставимые значения были записаны через 24 часа после нанесения покрытия.

Эти наблюдения показывают, что изолированные клетки Helix не проявляют какой-либо продолжительной спонтанной активности, вызванной применением 5-HT, в отличие от полисинаптических цепей, зарегистрированных на устройствах MEA (рис. 4).

Кроме того, мы также исследовали, можно ли приписать активность 5-HT-обработанных цепей изменениям в клеточной возбудимости, рассматривая скорость возбуждения отдельных клеток, индуцированную импульсом деполяризации (+ 0,5 нА в течение 10 с). Изолированные нейроны B2 показали одинаковый ответ во всех экспериментальных группах (рис. 6D). Интересно, что мы наблюдали общее увеличение возбудимости от 6 до 24 часов в нейронах C1 (рис. 6E). Двусторонний дисперсионный анализ для повторных измерений подтвердил значительный эффект времени (F (2,25) = 34.39, P <0,0001). В данном случае применение серотонина вызвало быстрое и сильное увеличение скорости возбуждения, что является статистически значимым по сравнению с контрольной и обработанной KCl группами (5-HT: 3,300 ± 0,661 пиков / с, n = 11; по сравнению с контролем: 0,357 ± 0,192 пиков / с, n = 7; по сравнению с KCl: 0,110 ± 0,023 пиков / с, n = 10; P <0,001, апостериорный тест Бонферрони ). Таким образом, мы можем сделать вывод, что нейроны C1 несут рецепторы, отвечающие на серотонин, которые участвуют в регуляции их возбудимости без изменения их мембранного потенциала, как это наблюдается в гомологичной метацеребральной клетке Aplysia [20, 21].

Во всех экспериментальных группах мы не наблюдали изменений в других свойствах мембраны, таких как входное сопротивление, пороговый потенциал и потенциал покоя (данные не показаны). Мы также оценили наличие изменений в кинетике потенциала действия (AP), измеряя амплитуду пика, длительность полуширины AP, время нарастания AP, время распада AP, постгиперполяризацию и реобазу. Для каждого параметра не было обнаружено различий между обработанной и контрольной группами (данные не показаны).

Обработка 5-HT и KCl модулирует рост нейритов в схеме

Helix

Чтобы лучше понять динамику возбуждения и функциональные связи, выведенные из записей MEA, была проведена параллельная оценка роста нейритов и морфологической сети.Мы измерили количество нейритов, соединяющих нейроны в одном кластере (внутри кластера), и среди 4 разных кластеров плотность нейритов (между кластерами), чтобы оценить плотность нейритов. Первоначально данные, измеренные с помощью нейронов C1 и B2, анализировались отдельно: мы решили включить эти значения в одну группу, поскольку их темпы роста были очень похожи друг на друга.

Как показано на рисунке 7A, мы обнаружили общее и быстрое увеличение плотности нейритов внутри кластера со временем, достигающее предельного значения плато, определяемого ограниченной площадью поверхности, охватываемой каждым кластером (расстояние между двумя электродами = 200 мкм).Этот параметр зависит от лечения. Двусторонний дисперсионный анализ для повторных измерений выявил значительный эффект лечения (F (2,29) = 48,53, P <0,0001) и времени (F (2,6) = 466,7, P <0,0001) и значительное лечение временным взаимодействием (F (12,174) = 17,12, P <0,0001). В частности, мы наблюдали статистически значимое снижение плотности внутрикластерных нейритов в цепях, обработанных 5-HT ( n = 12), которое началось с 24 часов и сохранялось в следующие моменты времени, достигая значения 0.029 ± 0,002 нейритов / мкм 2 по сравнению с 0,040 ± 0,002 нейритов / мкм 2 контрольной группы ( n = 12) через 72 часа ( P <0,001, апостериорный тест Бонферрони ) . Напротив, нанесение раствора с высоким содержанием калия вызывало увеличение плотности нейритов с 0,051 ± 0,001 нейритов / мкм 2 , измеренных через 72 часа ( n = 8; P <0,001, апостериорный тест Бонферрони ). .

Рис. 7

Обработка KCl и 5-HT влияет на морфологическую связность Helix . ( A ) Гистограмма плотности нейритов внутри кластера. Мы обнаружили, что применение KCl увеличивает количество нейритов, соединяющих четыре клетки одного кластера. Напротив, после лечения 5-HT наблюдалось статистически значимое снижение. Аналогичные результаты были получены с учетом того, что нейриты проецируются из одного кластера в другой (межкластерная плотность). В ). В то время как 5-HT вызывал заметное снижение, менее выраженное увеличение было обнаружено в сетях, обработанных KCl.( C ) Гистограмма скорости роста нейритов, показывающая, что применяемые обработки не вызывали дефектов роста.

Мы также рассмотрели межкластерную плотность нейритов как показатель дальнодействующих нейритов, отражающий предполагаемые связи между четырьмя кластерами (рис. 7В). В течение первых часов развития не наблюдалось ни одного или нескольких взаимосвязанных нейритов, подтверждающих, что распространение сигнала в соответствующих записях ограничивалось самим кластером. Плотность межкластерных нейритов линейно увеличивалась с 24 до 72 часов с аналогичными значениями в группе, обработанной KCl, и в контрольной группе.Расстояние между кластерами (600–1000 мкм) гарантировало непрерывное расширение нейритов без увеличения значения плато. Мы обнаружили, что это усиление было значительно нарушено применением серотонина (то есть через 72 часа: 0,008 ± 0,002 нейритов / мкм 2 по сравнению с 0,018 ± 0,003 нейритов / мкм 2 контрольной группы; P <0,001, Бонферрони апостериорный тест ).

Чтобы напрямую оценить наличие дефицита роста, вызванного однократным нанесением серотонина, мы измерили скорость удлинения нейритов в различные моменты времени.Аналогичные значения были обнаружены во всех экспериментальных группах, что позволяет предположить, что подвижность конуса роста не была затронута (рис. 7C). Таким образом, более низкая плотность нейритов может быть приписана прямому эффекту серотонина, а не нарушению роста, как это наблюдается в других моделях [22-24].

Сети Helix отображают функциональные связи во время разработки

Для исследования общей связности цепей мы проанализировали, были ли синаптические связи, обнаруженные в сложных полисинаптических цепях нейронов C1 и B2, сформированы в соответствии с предыдущими электрофизиологическими характеристиками отдельных моносинаптических пар [5] и были ли разные методы лечения (т.е., KCl или 5-HT) модулируют функциональные связи, принимая во внимание доказательства того, что плотность нейритов увеличивается с помощью KCl и снижается с помощью 5-HT (см. Фигуры 7A и 7B).

На фиг. 8 показаны два примера карт функциональной связности (FC) относительно обработки KCl (фиг. 8A) и 5-HT (фиг. 8B), оцененных через 48 th часов после нанесения покрытия. Сообщалось о двух репрезентативных кросс-корреляциях (CC) рядом с соответствующими функциональными связями: релевантное различие между обработкой KCl и 5-HT на кросс-коррелограммах — это пиковая амплитуда (примерно на один порядок величины; см., а также рисунок 9 для подробной характеристики). Карты FC были выведены из CC, оцененных среди всех активных электродов. Следуя подходу, предложенному в [25, 26], мы отсортировали все статистически значимые ссылки на основе их силы и приняли во внимание только 8 самых сильных ссылок. Таким образом, вероятно, мы рассматриваем наиболее надежные соединения, которые соответствовали бы физическим соединениям. Из анализа FC мы не нашли никаких соответствующих межкластерных функциональных связей, даже если мы наблюдали некоторые дальнодействующие связи в морфологическом анализе (рис. 7B).Взаимодействие, измеренное с помощью CC, предполагает, что такие удаленные нейроны функционально не связаны. Фактически, мы обнаружили среди межкластерных электродов: i) шумные и незначительные СС; ii) CC-пики попадают в ячейку с центром в нуле, таким образом, представляя случайную совместную активацию [26].

Рисунок 8

Функциональные карты подключения. Примеры функциональных карт связности, оцененных для 8 самых сильных связей в культуре, обработанной с помощью ( A ) KCl или ( B ) 5-HT.Сила соединения обозначается цветной стрелкой: от красного (сильное) до белого (слабое). Внутри карт приведены два примера кросс-коррелограмм. Масштабные линейки: A: x — ось: 90 мс, y — ось: 0,2. B: x — ось: 90 мс, y — ось: 0,01.

Рисунок 9

Характеристика функциональных связей в процессе разработки. ( A ) Число обнаруженных функциональных связей в культурах нейронов Helix , обработанных KCl (черная линия) и 5-HT (красная линия).( B ) Тенденция пиковых значений кросс-коррелограммы в процессе разработки (KCl черный, 5-HT красный). ( C ) Оценка синаптической задержки: в случае лечения 5-HT задержки всегда выше, чем соответствующие с KCl. ( D E ) Схематические изображения AP внутриклеточно, записанные из пре- и постсинаптических клеток, связанных химическим ( A ) или электрическим ( B ) соединением. Первые производные сигналов показаны на нижних панелях.( F ) Гистограмма, показывающая средние синаптические задержки, измеренные в зависимости от типа соединения (химического и электрического), по сравнению с типом лечения (5-HT и KCl).

Обработка 5-HT и KCl модулирует силу и латентность синапсов.

Как и предполагалось в предыдущем разделе, есть свидетельства того, что эти два лечения модулируют FC нейронных сетей Helix . Таким образом, чтобы охарактеризовать функциональные связи, мы оценили для всех культур и в процессе их развития прочность (т.е., пиковое значение кросс-коррелограммы) и задержка (то есть разница во времени между возникновением пика кросс-коррелограммы и нулем).

На рис. 9А показано количество обнаруженных соединений как функция развития сети, усредненное по количеству культур (т. Е. 3 и 2 сети на химическую обработку 5-HT и KCl, соответственно). Все обнаруженные соединения были внутрикластерными, так как никаких межкластерных связей обнаружено не было. Фактически это означает, что мы имели дело с 12 и 8 нефункционально связанными сетями, обработанными 5-HT и KCl соответственно.KCl вызывает увеличение количества связей по сравнению с сетями, управляемыми с помощью 5-HT, показывая результаты, аналогичные результатам измерения плотности нейритов (рис. 6А). Через 54 часа in vitro сети, обработанные KCl, достигли стабильного значения функциональных связей, в то время как в случае 5-HT наблюдалась линейная монотонная тенденция. Интересно, что KCl-опосредованные связи были сильнее, чем 5-HT (через 6 часов in vitro). Тенденция расчетной силы синапсов показала пик примерно на отметке 30 th часов (0.56 ± 0,09) и сходятся к асимптотическому значению (0,30 ± 0,003). Напротив, оценочная синаптическая сила сетей 5-HT была практически плоской с небольшими колебаниями и небольшим значением около 0,03 (на порядок меньше, чем стимуляция KCl).

Затем мы охарактеризовали функциональные связи как задержки между взаимно коррелированными электродами. Сети, обработанные KCl, показали относительно быструю синаптическую передачу (около 5 мс), которая оставалась довольно постоянной во время развития (рис. 9С).При лечении 5-HT синаптическая передача была намного медленнее: через 6 часов in vitro средняя латентность уже достигла плато, равного 20,4 ± 0,43 мс.

Из литературы известно, что нейроны Helix могут образовывать как химические, так и электрические синапсы в культуре [5]. Поэтому мы рассматриваем возможность того, что два измеренных диапазона латентности могут быть связаны с типом соединения, в частности с синаптической задержкой. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы проверили изолированные пары нейронов C1-B2 и B2-B2 на наличие синаптических связей.Данные внутриклеточной записи активирующих нейронов были вычислительно преобразованы в первую производную для воспроизведения внеклеточных сигналов, полученных с помощью устройств MEA (рис. 9D и E). Эта манипуляция оправдана предыдущими исследованиями моделирования, в которых соединение нейрон-микротрансдуктор и внеклеточная записанная форма волны были математически смоделированы и охарактеризованы [27–29]. Затем мы измерили время задержки, которое произошло между двумя AP, одна в пресинаптической клетке, а другая в постсинаптическом нейроне, вызванная первым сигналом (см. Методы).Мы заметили, что электрически соединенные между собой ячейки всегда срабатывают синхронно с соотношением 1: 1. Напротив, потенциалы действия, зарегистрированные от химически связанных нейронов, не всегда были связаны друг с другом. Фактически, возбуждающий постсинаптический потенциал (ВПСП), вызванный пресинаптическим возбуждением, может быть недостаточным для запуска нового потенциала действия в постсинаптическом нейроне. Например, ВПСП могут не достигать порогового потенциала или, альтернативно, могут возникать во время фазы реполяризации, когда нейрон невосприимчив к стимуляции.Эти сигналы могут привести к колебаниям мембранного потенциала, которые не могут быть обнаружены устройствами MEA. Поэтому мы решили включить в этот анализ только всплески, которые эффективно коррелируют друг с другом. Мы обнаружили, что химические и электрические синапсы характеризуются задержками, равными 26,9 ± 2,5 мс и 5,4 ± 1,1 мс соответственно (рис. 9F). Такие значения согласуются с найденными на уровне сети (средние значения 24,7 ± 0,8 мс и 5,3 ± 0,3 мс через 48 часов) при обработке 5-HT и KCl, соответственно.

Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что обработанные KCl сети Helix преимущественно связаны между собой посредством электрических синапсов, характеризующихся надежными сигналами, синхронным возбуждением и сильной связью с короткой задержкой. С другой стороны, полисинаптические цепи, в которых 5-HT применялся неоднократно, были образованы химическими связями, что объясняет более слабую связь и большую задержку. Следовательно, мы можем сделать вывод, что усиление электрической передачи по сравнению с химической передачей в цепях Helix может быть сильно усилено посредством добавления KCl, и наоборот в случае 5-HT.

Противовирусная активность кольцевой тройной спирали, формирующей олигонуклеотидную РНК в отношении репликации вируса инфекционного перитонита кошек, in vitro

Инфекционный перитонит кошек (FIP) — это тяжелое смертельное заболевание с усиленным иммунитетом в популяции кошек. Это вызвано вирусом FIP (FIPV), вирулентным мутантным штаммом кишечного коронавируса кошек (FECV). Современные методы лечения и профилактики неэффективны. Антивирусные свойства in vitro пяти кольцевых трехспиральных олигонуклеотидных (TFO) РНК (от TFO1 до TFO5), которые нацелены на различные области генома вирулентного коронавируса кошек (FCoV) штамма FIPV WSU ​​79-1146, были протестированы в FIPV- инфицированные клетки почки кошек Crandell-Rees (CRFK).Результаты RT-qPCR показали, что кольцевые РНК TFO, за исключением TFO2, ингибируют репликацию FIPV, при этом число копий вирусного генома значительно уменьшилось в 5 раз, логарифм 10 с 10 14 в клетках, инокулированных вирусом, до 10 9 в клетках, трансфицированных кольцевыми РНК TFO. Кроме того, связывание кольцевой РНК TFO с целевым сегментом вирусного генома было также подтверждено с помощью анализа сдвига электрофоретической подвижности. Сила кинетики связывания между РНК TFO и их целевыми областями была продемонстрирована с помощью анализа NanoITC.В заключение можно сказать, что кольцевые TFO имеют потенциал для дальнейшего развития в качестве противовирусных агентов против инфекции FIPV.

1. Введение

Вирус инфекционного перитонита кошек (FIPV) представляет собой оболочечный вирус с несегментированным позитивно смысловым одноцепочечным геномом РНК. FIPV сгруппирован как коронавирус кошек (FCoV) в семействе Coronaviridae. FCoV подразделяется на два биотипа, а именно: энтерический коронавирус кошек (FECV), широко распространенный кишечный биотип FCoV, и FIPV, вирулентный биотип FCoV [1].Взаимосвязь этих двух биотипов до сих пор остается неясной. Были предложены две гипотезы: (i) теория внутренней мутации и (ii) распространенная теория высокой-низкой вирулентности. Теория внутренней мутации утверждает, что развитие FIP происходит из-за воздействия на кошку вариантов FCoV, которые были мутированы за счет обретения способности реплицироваться внутри макрофагов [2], в то время как теория циркулирующих высоко-вирулентных и низковирулентных вирусов объясняет существование как отличительные патогенные, так и доброкачественные линии вирусов в популяции кошек [3].

Исследование показало, что около 40–80% кошек обнаруживаются с выделением FECV с фекалиями [4]. Около 12% этих кошек с положительной реакцией на FECV заболевают иммуноопосредованным смертельным заболеванием FIP [4]. Распространенность FIP среди кошачьих обусловлена ​​постоянными циклами инфицирования и повторного инфицирования FECV и неразличимыми клиническими симптомами у инфицированных кошек FECV на ранней стадии до прогрессирующего развития FIPV.

Вакцинация против FIPV ослабленным, чувствительным к температуре штаммом FIPV типа II вызывает низкий титр антител у котят, которые не подвергались воздействию FCoV.Однако существуют серьезные разногласия по поводу безопасности и эффективности этой вакцины, поскольку вакцина содержит штамм типа 2, тогда как вирусы типа 1 более распространены в этой области [4]. Кроме того, антитела против FIPV не защищают инфицированных кошек, но усиливают инфицирование моноцитов и макрофагов с помощью механизма, известного как антитело-зависимое усиление [1]. Помимо вакцин, несколько противовирусных препаратов, таких как рибавирин, интерфероны и иммунодепрессанты, использовались для лечения кошек, инфицированных FIPV, в основном для подавления воспалительного и вредного иммунного ответа [5–8].Однако это лечение было неэффективным. Следовательно, все еще существует значительная неудовлетворенная потребность в медицине в разработке эффективных методов лечения и профилактики инфекции FIPV.

Тройной спиралиобразующий олигонуклеотид (TFO) определяется как гомопиримидиновые олигонуклеотиды, которые могут образовывать специфичную для последовательности тройную спираль за счет связей Хугстина с большой бороздкой комплементарного участка гомопиримидин-гомопурин в дуплексной ДНК [9]. Кроме того, двойная спиральная РНК или гибриды ДНК-РНК могут быть нацелены в качестве матрицы для образования тройной спирали, как только будет определен состав цепи по стабильности тройных спиральных комплексов [10].Следовательно, TFO использовался для препятствования экспрессии генов путем ингибирования транскрипции вирусных генов или онкогенов [11–16]. Основная цель этого исследования — разработать и оценить противовирусные свойства in vitro кольцевых РНК TFO против репликации FIPV.

2. Материалы и методы
2.1. Клетка и вирус

Вирус инфекционного перитонита кошек (FIPV) серотипа II штамм WSU 79–1146 (ATCC № VR-1777) выращивали в клетках CRFK. Из рабочего материала готовили серийное 10-кратное разведение FIPV.Конфлюэнтный 96-луночный планшет инокулировали 100 мкл мкл каждого разведения вируса на лунку. Планшет инкубировали в увлажненном инкубаторе при 37 ° C, 5% CO 2 . Наблюдалось развитие цитопатических эффектов (ЦПЭ). Результаты были зарегистрированы через 72 часа, и инфекционная доза 50 для культуры ткани вируса (TCID 50 ) была рассчитана с использованием метода Рида и Мюнха [17].

2.2. Получение кольцевой тройной спирали, образующей олигонуклеотидную РНК

Тройную спираль, образующую олигонуклеотиды (TFO), были разработаны на основе геномной последовательности штамма WSU 79–1146 серотипа II FIPV (номер доступа: AY994055) [18].Были сконструированы TFO, которые специфически нацелены на разные области генома FIPV, и один неродственный TFO (Таблица 1). Специфичность TFO была определена с помощью поиска BLAST в базе данных NCBI. Разработанные линейные TFO были синтезированы Dharmacon Research (США), при этом 5′- и 3′-концы линейных TFO были модифицированы фосфатной (PO 4 ) группой и гидроксидной (OH) группой соответственно. Эти модификации были необходимы для циркуляризации линейных TFO. Процесс циркуляризации с использованием РНК-лигазы 1 Т4 (оцРНК-лигаза) (New England Biolabs Inc., Англия), проводилась согласно протоколу производителя. После лигирования кольцевые РНК TFO выделяли осаждением этанолом, и чистоту кольцевых РНК TFO измеряли с помощью спектрофотометра.

CGAACA GAGA GGA1 90atagacta

TFO Последовательности TFO Целевая последовательность * Целевой ген и положение

905AGA GGA1
50 ′ tataa ctcttcttttacttt aacta 3 ′ 5′UTR и 36–50
TFO2 AAAAGGAAAA
C C
C C
AAAAGGAAAA
5 ′ UTR и 29335–29344
TFO3 GGAUAAGAGGAA
C C
C C
GGACAAGAGGAA
5 ‘ttaaa cctgttga165 ′ AAAGAGGGGAGAA
C C
C C
AA AGAGGUGAGAA
5 ‘cagga tttctccactctt agttc 3′ ORF1a / 1b и 7399–7411
TFO5 AAAGGGAAGAAAGA
C CAGAAAGA
C

C

06 CAGTGAA
C

06 CAGTGA
C CAGT
C 3 ′
ORF1a / 1b и 14048–14061
TFO7 ** UUUUUAUUUUUAU
C C
C C
UUUUUAU1413 905 905 905 905 905 905 905 905 905 905 905 905
Полужирным шрифтом выделена область связывания.
Несвязанный циркулярный TFO.
2.3. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле

Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле мочевины проводили, как описано ранее [19], с модификацией. Вкратце, получали 20% геля полиакриламида денатурированной мочевины и полимеризовали в течение 30 минут. Затем гель предварительно прогоняли при 20-40 В в течение 45 минут. Пять мкл л РНК TFO, смешанных с 5 мкл л буфера для загрузки мочевины, нагревали при 92 ° C в течение 2 минут и немедленно охлаждали на льду.Его прогоняли на геле при 200 В в течение 45 минут. Наконец, гель окрашивали бромидом этидия (Sigma, США) и просматривали с помощью системы Bio-Rad Gel Doc XR (Калифорния, США).

2.4. Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA)

Целевые области генома FIPV были синтезированы Dharmacon Research (США) (таблица 1). Каждую РНК TFO смешивали с целевой областью в 1X связывающем буфере, содержащем 25 мМ Трис-HCl, 6 мМ MgCl 2 и 10 мМNaCl в конечном объеме 10 мкл л, а затем инкубировали при 37 ° C в течение 2 часов. .Образец прогоняли на 15% натуральном полиакриламидном геле при 80 В в холодных условиях. Окрашенный гель просматривали с помощью системы Bio-Rad Gel Doc XR.

2,5. Взаимодействие между кольцевыми РНК TFO и целевыми областями

Силу связывания измеряли с использованием наноизотермического калориметра для титрования (ITC) (TA instruments, Newcastle, UK). Смеси образцов РНК, состоящие из кольцевых ТФО (0,0002 мМ), инкубировали с их соответствующими синтетическими целевыми областями (0,015 мМ), используя 1X связывающий буфер в качестве разбавителя.Эксперимент проводили при 37 ° C с 2 мкл л на инъекцию, всего 25 инъекций. Данные собирались каждые 250 секунд и анализировались с помощью программного обеспечения NanoAnalyze v2.3.6, предоставленного производителем.

2.6.
In vitro Противовирусный эффект TFO по отношению к FIPV

Этот эксперимент проводили на клетках CRFK, где 3 × 10 4 клеток / лунку засевали в 96-луночный планшет для достижения 80% конфлюэнтности за 24 часа до трансфекции. Сто нМ РНК TFO отдельно трансфицировали в клетки CRFK с использованием реагента для трансфекции HiPerFect (Qiagen, Германия) в соответствии с протоколом производителя.Планшет инкубировали при 37 ° C с 5% CO 2 в течение 6 часов. Затем культуры инфицировали 100TCID 50 штамма FIPV серотипа II WSU 79–1146 в течение 1 часа при 37 ° C (100 мкл л / лунку). Наконец, вирусный инокулят заменяли свежей поддерживающей средой (MEM, содержащей 1% FBS и 1% pen / strep). Зараженные вирусом и неинфицированные клетки поддерживали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Морфологию культур регистрировали через 72 часа после заражения, и в этот момент времени собирали образцы и хранили при -80 ° C перед экстракцией РНК.

2.7. Доза-ответ кольцевой РНК TFO при ингибировании репликации FIPV

Различные концентрации кольцевой РНК TFO1 (25 нМ, 50 нМ, 100 нМ и 500 нМ) трансфицировали в клетки CRFK. Планшет инкубировали в течение 6 часов с последующим заражением вирусом в течение 1 часа при 37 ° C с 5% CO2. Клетки обрабатывали, как описано выше.

2,8.
In vitro Исследование специфичности кольцевых РНК TFO в отношении вируса гриппа A

Клетка Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) (ATCC No.CCL-34) в концентрации 4 × 10 4 клеток / лунку высевали в 96-луночный планшет для достижения 80% конфлюэнтности за 24 часа до трансфекции. Трансфекцию проводили так же, как и раньше. Сто нМ кольцевой РНК TFO трансфицировали в клетки MDCK. После 6 часов инкубации раствор удаляли и 100TCID 50 вируса гриппа A подтипа h2N1 New Jersey 8/76 (ATCC VR-897) инокулировали в планшет на 1 час при 37 ° C. Вирусные инокуляты заменяли модифицированной по Дульбекко средой Игла (DMEM) (Mediatech Cellgro Company; Нортбрук, Иллинойс, США), содержащей трипсин- (тозиламид-2-фенилэтилхлорметилкетон) TPCK (Sigma, США).Образцы собирали через 48 часов и хранили при -80 ° C перед экстракцией РНК.

2.9. Количественная ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени

Вирусную РНК экстрагировали из 100 мкл л собранной клеточной культуры с использованием набора для экстракции вирусной РНК QIAamp (Qiagen, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Зараженные вирусом и неинфицированные клетки поддерживали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Праймеры для амплификации FIPV и h2N1 (таблица 2) были основаны на установленных ранее праймерах, сконструированных ранее [20, 21], соответственно.Количественную ПЦР в реальном времени с обратной транскриптазой (RT-qPCR) проводили с использованием системы реального времени Bio-Rad CFX96 (BioRad, США). Реакцию амплифицировали до конечного объема 25 мкл л с использованием набора для одностадийной реакции SensiMix SYBR No-ROX (Bioline, UK), который состоял из 12,5 мкл л 2X буфера для одноэтапной реакции SensiMix SYBR No-Rox. , 10 мкМ, М прямых и обратных праймеров, 10 единиц ингибитора РНКазы RiboSafe и 5 мкл L матричной РНК. Подход абсолютной количественной оценки использовался для количественной оценки результатов кПЦР, когда перед количественной оценкой строилась стандартная кривая серийного разведения вируса.Количество вируса в образцах определяли количественно на основе этой стандартной кривой.


Мишень Праймер Последовательность праймера (от 5 до 3 дюймов) Расположение Ссылка Размер ампликона (т. FIPV-F GGCAACCCGATGTTTAAAACTGG 29082-29105 Herrewegh et al.(1995) [20] 223
FIPV-R CACTAGATCCAGACGTTAGCTC 29305-29283
h2N1 M2-F CAGAC5 M2-F CAGAC 5 Mehrbod et al. (2012) [21] 147
M2-R AGC AAC GAG AGG ATC ACT TG 760-779

2 Статистический анализ

Статистический анализ данных был выполнен с использованием SPSS 18.0. Данные были представлены как среднее значение ± стандартная ошибка трех независимых тестов. Односторонний дисперсионный анализ ANOVA, апостериорный тест Тьюки был использован для анализа значимости данных. считалось значительным.

3. Результаты
3.1. Дизайн кольцевых РНК TFO против FIPV

Циркулярные РНК TFO, нацеленные на геном FIPV, были разработаны в соответствии с методом образования тройной спирали, описанным Vo и его коллегами [22], с модификацией. Три различных участка генома FIPV, которые играют важную роль в репликации вируса, были выбраны в качестве сайтов связывания-мишени для образования триплекса.Целевыми областями были 5 ‘нетранслируемая область (5’ UTR), открытые рамки считывания (ORF) 1a и 1b и 3 ‘нетранслируемая область (3’ UTR) (таблица 1). TFO были разработаны в виде дуплекса, так как они могут связываться с одноцепочечной целевой областью и преобразовываться в триплекс. Оба конца дуплекса TFO были лигированы линкерной последовательностью или зажимами (C-C) для конструирования кольцевой РНК TFO.

3.2. Определение кольцевой РНК TFO

Денатурирующий анализ PAGE проводили после процесса лигирования для определения образования кольцевого TFO.Как показано на рисунке 1, кольцевые РНК TFO мигрировали быстрее, чем линейные РНК TFO, когда подвергались 20% денатурирующему PAGE.


3.3. Связывающая способность кольцевой РНК TFO по отношению к ее целевой области

Связывающую способность определяли с помощью анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) [23]. Появление полосы медленной подвижности указывает на успешную гибридизацию кольцевой РНК TFO с ее областью-мишенью. Связывающую способность различных РНК TFO (TFO1-TFO5) против их целевых областей определяли с помощью EMSA (рис. 2).TFO1, TFO3, TFO4 и TFO5 показали полосу медленной подвижности, тогда как TFO2 показал отсутствие полосы, смещенной вверх. Это указывает на обладание триплексной связывающей способностью для всех кольцевых РНК TFO, кроме TFO2.


3.4. Исследование кольцевой РНК TFO с помощью калориметра нано-изотермическим титрованием

Исследование взаимодействия и гибридизации TFO с его целевой областью имеет решающее значение, поскольку чем сильнее связывание, тем стабильнее формируется триплексная структура. Как показано на дополнительном рисунке 1 (в дополнительных материалах, доступных онлайн по адресу http: // dx.doi.org/10.1155/2014/654712), все кольцевые РНК TFO (кроме TFO2) показали высокие уровни константы ассоциации (). Следовательно, все кольцевые РНК TFO (кроме TFO2) регистрировали низкое значение константы диссоциации () в обратной зависимости от этого значения. TFO1 показал наименьшее значение (таблица 3).

9905

Циркулярная РНК TFO (константа ассоциации) (константа диссоциации) (нМ)

3458
2
3 9359929,6 107
4 8446828 118
находится в обратной зависимости от.
3.5. Противовирусный эффект кольцевых РНК TFO против FIPV

Противовирусный эффект кольцевых РНК TFO исследовали с помощью анализа RT-qPCR через 72 часа после трансфекции.Результаты показали, что число копий генома вирусной РНК составляет 3,65 × 10 9 , 3,22 × 10 14 , 5,04 × 10 9 , 5,01 × 10 9 , 4,41 × 10 9 и 3,96 × 10 14. в клетках, обработанных TFO1, TFO2, TFO3, TFO4, TFO5 и TFO7 соответственно. Данные, проанализированные с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), апостериорного теста Тьюки, показали значительное высокое число копий вирусного РНК генома 4,03 × 10 14 для инокулированных вирусом клеток по сравнению с циклическими обработками TFO1, TFO3, TFO4 и TFO5 ().Копии вирусной РНК кольцевых клеток TFO2, линейных TFO3 и TFO4 и неродственных кольцевых РНК TFO7, трансфицированных клетками, также показали высокие числа копий вирусной РНК, которые не показали значительных отличий от инфицированных клеток () (рис. 3). Морфологические изменения клеток также фиксировались через 72 часа после трансфекции. Клетки, трансфицированные кольцевым TFO1, TFO3, TFO4 и TFO5, оказались в хорошем состоянии после инокуляции вируса, в то время как клетки, трансфицированные кольцевым TFO2 и линейным TFO3 и TFO4, показали видимый цитопатический эффект (CPE), такой же, как и клетки, инокулированные вирусом ( дополнительный рисунок 2).Кроме того, клетки, трансфицированные TFO, остаются только жизнеспособными, что указывает на то, что обработка TFO обычно не токсична для клеток. Следовательно, эти результаты иллюстрируют способность кольцевых РНК TFO (кроме TFO2) ингибировать репликацию FIPV.


3.6. Влияние кольцевой РНК TFO в различных концентрациях на репликацию FIPV

Циркулярный TFO1 был использован для исследования зависимости доза-ответ в качестве представителя других TFO. Условия эксперимента были идентичны условиям предыдущего эксперимента, за исключением концентраций TFO1 25 нМ, 50 нМ, 100 нМ и 500 нМ.Не наблюдалось значительного снижения копий вирусного генома РНК при использовании концентрации 25 нМ TFO1. Другие концентрации вызывали значительное уменьшение числа копий по сравнению с клетками, инфицированными вирусом. Однако не было обнаружено значительной разницы в количестве копий для всех этих концентраций (рис. 4).


3,7. Противовирусное действие кольцевых РНК TFO на неродственный вирус

Специфичность TFO по отношению к FIPV была протестирована с использованием TFO1 и TFO5, как подходящих представителей TFO, на вирусе гриппа A h2N1 New Jersey 8/76.Данные, проанализированные с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), апостериорного теста Тьюки, не показали значительного снижения количества копий вирусной РНК для обоих TFO по сравнению с клетками, инокулированными вирусом гриппа () (дополнительная фигура 3).

4. Обсуждение и заключение

Кошачий Инфекционный перитонит — смертельное заболевание среди кошачьих популяции. Современные методы лечения и вакцины неэффективны для борьбы с болезнью. 5 ‘и 3’ UTR вирусной мРНК представляют собой высококонсервативные последовательности и играют важную роль в процессе репликации [24].Между тем, ORF1a / 1b FIPV транслируется в полипротеины, которые расщепляются на неструктурные белки, которые собираются в репликационно-транскрипционные комплексы вместе с другими вирусными белками [24]. Следовательно, разработка молекулярной терапии, нацеленной на эти критические области, может предоставить возможность ингибировать репликацию FIPV.

Разработка противовирусных препаратов против FIPV с использованием миРНК [25] и ингибиторов вирусных протеаз [26] была протестирована в качестве потенциальных новых методов лечения инфекции FIPV.В этом исследовании были разработаны и оценены кольцевые РНК олигонуклеотидов, образующих тройную спираль (TFO), специально нацеленные на короткие области вирусного генома для образования триплекса. TFO1 и TFO2 нацелены на 5 ‘и 3’ UTR вирусного генома, соответственно. TFO3 в TFO5 нацелены на различные области ORF1a / 1b в геноме FIPV. Перед антивирусным исследованием in vitro лигированные кольцевые TFO оценивали с помощью анализа PAGE. Все циркулярные TFO показали более быструю картину миграции по сравнению с линейными TFO; однако для некоторых TFO было обнаружено лишь небольшое изменение (рис. 1).Причина этого не ясна, но, вероятно, из-за различий в длине и третичной структуре TFOs, приводящих к различиям в скорости миграции. EMSA использовали для демонстрации способности каждого кольцевого TFO связываться с целевой областью в геноме FIPV, за исключением TFO2, который показал отсутствие образования сложной структуры при гибридизации (рис. 2). Результат EMSA также совпал с результатами антивирусного исследования, в котором все кольцевые TFO (кроме TFO2) продемонстрировали значительное снижение числа копий вирусного РНК генома на 5-кратный логарифм 10 с 10 14 в зараженных вирусом клетках до 10 9 в клетках, трансфицированных ТФО (рис. 3).Однако не было обнаружено противовирусных свойств линейных TFO и неродственных кольцевых РНК TFO7, что подтверждает, что противовирусная активность связана со специфическим связыванием кольцевых TFO с целевыми областями.

Кроме того, связывание кольцевого TFO с целевой областью было подтверждено анализом nanoITC; где низкое значение и высокая стабильность позволяют TFO эффективно конкурировать с целевыми областями для ингибирования транскрипции в бесклеточных системах. Поскольку TFO1 показывает самое низкое значение (таблица 3), противовирусные свойства этого TFO оценивались в исследовании «доза-реакция».Как показано на фиг. 4, 50 и 100 нМ TFO1 показали сходные противовирусные эффекты, что указывает на потенциальное терапевтическое применение TFO1 в отношении репликации FIPV. Однако увеличение концентрации TFO1 до 500 нМ не привело к дальнейшему снижению вирусной нагрузки, вероятно, из-за неэффективности реагента для трансфекции трансфекции TFO в клетки. Кроме того, вирус имеет высокую скорость репликации при инфицировании in vitro , где предыдущее исследование роста FIPV в клетках CRFK показало, что через 2 часа приблизительно 67% FIPV 79-1146 были интернализованы клетками CRFK за счет эндоцитоза, увеличиваясь до более более 70% через 3 часа [27, 28].Вышеуказанное открытие, вероятно, также объясняет причину, по которой не было обнаружено противовирусного эффекта, когда трансфекция TFO выполнялась на инфицированных вирусом клетках (данные не показаны).

Противовирусные свойства, как продемонстрировали кольцевые TFO, вероятно, были связаны со связыванием TFO с целевой областью на основе водородных связей Уотсона-Крика и Хугстина, которые повышают стабильность с точки зрения энтальпии, т.е. вызвано соединением вместе двух из трех нитей тройной спирали в правильной ориентации [29].Следовательно, образование триплекса плотно связано и его нелегко отсоединить. Более того, кольцевые TFO были сконструированы таким образом, что присутствие доноров и акцепторов водородных связей в пуринах способно образовывать две водородные связи, в то время как пиримидиновые основания могут образовывать только одну дополнительную водородную связь с поступающими третьими основаниями [30]. Однако существуют различные факторы, которые могут ограничивать активность TFO в клетках, такие как внутриклеточная деградация TFO и ограниченная доступность TFO к сайтам-мишеням, что может предотвратить образование триплекса [31].Эти результаты могут также объяснить неспособность сконструированного TFO1 ингибировать дальнейшую репликацию вируса в исследовании зависимости реакции от дозы (рис. 4).

Разработаны и испытаны различные молекулярные методы лечения инфекционных заболеваний и рака. Однако только терапия на основе миРНК широко изучалась как новая противовирусная и противораковая терапия [32, 33]. Недавно McDonagh et al. [25] разработали миРНК с противовирусной активностью против FIPV 79-1146, при этом созданная миРНК была способна уменьшить количество копий вирусного генома по сравнению с инфицированными вирусом клетками.Потенциальное терапевтическое применение TFO, таких как линейный TFO, конъюгированный с псораленом, для ингибирования транскрипции провируса иммунодефицита человека [13] и TFO, чтобы ингибировать транскрипцию коллагена α 1 (I) в фибробластах крыс [14], также было исследовано. сообщил. Кроме того, короткий TFO, конъюгированный с дауномицином, нацеленный на промоторную область онкогена, был разработан и испытан на раковых клетках человека [31]. Эти исследования показали гибкость использования олигонуклеотидов на основе ТФО в качестве потенциальной молекулярной терапии.В этом исследовании мы продемонстрировали короткие кольцевые РНК TFO размером от 28 до 34 меров (таблица 1), которые способны ингибировать репликацию FIPV путем связывания со специфическими областями-мишенями генома FIPV.

Все разработанные кольцевые TFO (кроме TFO2) показали значительные ингибирующие эффекты против репликации FIPV. TFO, которые образовывали триплексные структуры, проявляли противовирусное действие в отношении репликации FIPV. Причина, по которой TFO2 не продемонстрировал какого-либо взаимодействия с целевой областью или противовирусной активности, вероятно, связана с длиной TFO2 (т.е.е., 24 мера), которого может быть недостаточно для образования триплекса при гибридизации (рис. 2), быть достаточно эффективным для подавления транскрипции вирусной РНК и, в конечном итоге, подавления репликации вируса. Тем не менее нельзя исключать неспособность TFO2 проявлять противовирусный эффект из-за нарушения формирования функциональной третичной структуры образования триплекса. Противовирусное исследование in vitro, которое не показало антивирусных свойств для неродственного TFO (TFO7), а также неспособность кольцевых TFO1 и TFO5 ингибировать клетки, инфицированные вирусом гриппа A h2N1, подтверждает специфичность активности TFO.

В заключение, кольцевая РНК TFO может быть разработана в качестве терапии против FIPV у кошек. Однако дальнейшие исследования специфичности TFO, фактического механизма циркулярной РНК TFO в следствии изменения транскрипции ингибирования процесса вирусной транскрипции и in vivo исследований на животных важны для того, чтобы этот подход работал в качестве терапии в будущем.

Конфликт интересов

Авторы заявили, что конфликта интересов не существует.

Вклад авторов

Ои Куан Чунг, Абдул Рахман Омар и Бимо Арио Теджо определили тему исследования. Ои Куан Чунг разработал и провел лабораторные эксперименты, проанализировал и интерпретировал данные и подготовил документ. Ои Куан Чунг, Абдул Рахман Омар и Парване Мехрбод тщательно отредактировали документ. Все авторы прочитали и одобрили финальную статью.

Благодарности

Работа поддержана грантом № ERGS / 1-2012 / 5527123 от Министерства высшего образования правительства Малайзии.Спонсор не принимал участия в разработке исследования, сборе и анализе данных или подготовке статьи.

Дополнительные материалы

Дополнительный рисунок 1. Анализ NanoITC. Анализ NanoITC измеряет аффинность связывания кольцевого TFO с его целевой областью. Константа диссоциации (Kd) равна 1 / константа ассоциации (Ka). Дополнительная фигура 2. Морфологические изменения клеток CRFK после обработки РНК TFO. FIPV-инфицированные клетки, подвергшиеся воздействию TFO, которые не проявляли цитопатического эффекта (CPE), указали на ингибирующие эффекты кольцевого TFO против репликации FIPV.Стрелки показывают CPE. 10-кратное увеличение. Дополнительная фигура 3. Противовирусная активность циркулярного TFO in vitro. Противовирусная активность TFO1 (A) и TFO5 (B) in vitro в отношении репликации h2N1 вируса гриппа A не показала значительного уменьшения числа копий вирусного РНК генома между клетками, трансфицированными РНК TFO, и нетрансфицированными клетками ( p ≥ 0,05). Данные представляют собой средние значения трех независимых тестов (среднее ± стандартная ошибка). Н.С.: не имеет значения.

  1. Дополнительные фигуры

Регулирование стабильности тройной спирали MALAT1 и разложения дифенилфуранов in vitro.

Опубликовано

Журнальная статья

Модуляция тройной спирали на основе малых молекул в длинном некодирующем РНК-метастаз-ассоциированном транскрипте аденокарциномы легкого 1 (MALAT1) была предложена в качестве привлекательного пути для лечения рака и модельной системы для понимания малых молекул: распознавания РНК. Чтобы выяснить фундаментальные принципы распознавания и взаимосвязи структура-функция, мы разработали и синтезировали девять новых аналогов небольшой молекулы на основе дифенилфурана DPFp8, ранее идентифицированного свинцового связующего MALAT1.Мы исследовали роль способов распознавания в исследованиях связывания и in silico, а также взаимосвязь между сродством, стабильностью и ферментативной деградацией in vitro тройной спирали. В частности, исследования молекулярного докинга выявили закономерности, определяющие аффинность и селективность, включая ограниченную гибкость лиганда, как наблюдали с помощью предварительной организации лиганда и комплементарности трехмерной формы для связывающего кармана. Использование дифференциальной сканирующей флуориметрии позволило быстро оценить индуцированную лигандом термостабилизацию тройной спирали, которая коррелировала со снижением деградации этой структуры in vitro экзонуклеазой РНКазы R.Величина стабилизации была связана с режимом связывания и селективностью между тройной спиралью и ее предшественницей, петлевой структурой стебля. В совокупности эта работа демонстрирует ценность библиотек на основе каркасов в раскрытии принципов распознавания и разработке широко применимых стратегий, включая функциональные анализы, для нацеливания малых молекул РНК.

Полный текст

Авторы герцога

Цитированные авторы

  • Донлик, А; Zafferani, M; Padroni, G; Пури, М. Харгроув, AE

Дата публикации

Опубликовано в

Том / выпуск

Начальная / конечная страница

PubMed ID

Pubmed Central ID

Электронный международный стандартный серийный номер (EISSN)

Международный стандартный серийный номер (ISSN)

Цифровой идентификатор объекта (DOI)

Язык

© 2021 г. Университет Дьюка | Условия использования | На базе VIVO

Ингибирование полимеризации Hb S in vitro с помощью нового пептида EF Helix ß73 His.| Кровь

Полимеризация серповидного гемоглобина вовлекает не только ß6 Val в в основном гидрофобный акцепторный карман, но и другие места контакта. Недавно мы обнаружили, что вариант ß73 His Hb S (ß6 Val и ß73 His) способствовал полимеризации по сравнению с дезокси-Hb S, тогда как ß73 Leu Hb S (ß6 Val и ß73 Leu) ингибировал полимеризацию, как дезокси Hb C-Harlem (ß6 Val и ß73. Асн). Фактически, ß73 Asp в Hb S образует водородную связь с ß4 Thr в дезокси-полимерах Hb S, и это уникальное положение для ускорения или ингибирования полимеризации путем замены аминокислот [Adachi et al., Biochemistry (2003), 42, 4476]. На кинетику полимеризации, растворимость и минимальную концентрацию, необходимую для полимеризации вариантов β73 Hb S, влияла аминокислота β73 (ингибирование полимеризации: His <

На основании этих результатов мы химически синтезировали 15-мерный пептид спирали EF, содержащий ß73 His (Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Ala-Phe-Ser-His-Gly-Leu-Ala-His-Leu-Asp ) и оценили влияние этого пептида на полимеризацию Hb S.DIC-анализ в 1,0 М фосфатном буфере показал индуцированное пептидом ингибирование скорости удлинения волокон для дезокси-Hb S, которая линейно возрастала с увеличением количества пептида (например, 5-кратный молярный избыток пептида приводил к 6-кратному уменьшению удлинения волокон. ставка). Растворимость дезокси-Hb S линейно увеличивается с увеличением пептида (например, 5-кратный молярный избыток пептида увеличивает растворимость в 1,2 раза). Время задержки перед полимеризацией дезокси-Hb S в буфере с высоким содержанием фосфата также значительно увеличивалось в присутствии этого пептида.Напротив, тот же 15-мерный пептид, содержащий ß73 Leu вместо His, не проявил никакого влияния на растворимость или кинетику полимеризации, что позволяет предположить, что пептид ß73 His специфически влияет на A-спираль Hb S, содержащего ß4 Thr, точно так же, как ß73 His Hb S вариант.

Добавить комментарий